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>1. Internalisierung von Bakterien in Wirtszellen (Fluoreszenzmikroskopie)
Hinweis: P. gingivalis ist mit 2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(und-6)-Carboxyfluorescein, Acetoxymethylester (BCECF-AM) markiert. BCECF-AM ist ein nicht-fluoreszierender membranpermeabler Farbstoff; Seine Umwandlung in Fluorescein BCECF über die Wirkung intrazellulärer Esterasen kann auf die Lebensfähigkeit der Zellen hinweisen. P. gingivalis wird mit dem Farbstoff BCECF-AM markiert und dann zur Infektion eukaryotischer Zellen verwendet. Nach der Infektion werden die Zellen fixiert und mit DAPI und TRITC-Phalloidin markiert. Die DAPI-Färbung, die zur Färbung des eukaryotischen Zellkerns verwendet wird, markiert auch den bakteriellen Zellkern, was eine Gegenmaßnahme zur Identifizierung nicht lebensfähiger Bakterien darstellt, die BCECF-AM nicht metabolisch spalten können. Wirtszellen werden mit TRITC-Phalloidin, einem roten Aktin-Farbstoff, hervorgehoben.
- Deckgläser für Autoklaven. Aseptisch Deckgläser auf 12-Well-Platten geben, bevor Endothelzellen mit 5 x 104 Zellen/Well ausgesät werden. (Vorbereitet am Tag vor dem Experiment)
- Lassen Sie Endothelzellen auf 18 mm (#1,5 Dicke) kreisförmigen Deckgläsern in 12-Well-Platten vorbereiten, wie oben beschrieben.
- Bereiten Sie anaerobe Bakterien vor, die in der mittleren logarithmischen Phase (OD660 = 0,5-0,7) gezüchtet wurden.
- Waschen Sie die Bakterien 2x mit anaerobem PBS, indem Sie bei 5.000 x g zentrifugieren und das Pellet in PBS bei 5-7 x 108 Zellen/ml suspendieren.
- 20 μl 0,2 mM BCECF-AM zu 2 ml Bakteriensuspension (5-7 x 108 Zellen/ml) bis zu einer Endkonzentration BCECF-AM von 2 μM geben.
Bei - 37 °C 30 min im Dunkeln inkubieren.
- Übertragen Sie Platten mit Endothelzellen, die auf 18 mm (#1,5 Dicke) kreisförmigen Deckgläsern ausgesät sind, aus dem Gewebekultur-Inkubator in die anaerobe Kammer. Mit PBS waschen und durch anaerobe VEGF-Medien austauschen.
Hinweis: Vergewissern Sie sich, dass HUVECs unter einem Lichtmikroskop gesund sind. HUVECS sollten ~80% konfluent sein, die Morphologie sollte mit der der Hersteller vergleichbar sein.
- Zentrifugieren Sie markierte Bakterien 10 Minuten lang bei 5.000 x g, um BCECF-AM-Farbstoffreste zu entfernen. In 2 ml anaeroben VEGF-Medien suspendieren.
- Infizieren Sie Wirtszellen mit markierten Bakterien bei einem MOI von 100:1 (Bakterien: Wirt).
In - einer anaeroben Kammer bei 37 °C 30 min inkubieren.
- Nach der Infektion die Zellen dreimal mit PBS waschen und in frisch zubereitetem 4,0%igem Paraformaldehyd für 10 min.
fixieren
Anmerkung: Nach der Fixierung der Zellen können Experimente außerhalb der anaeroben Kammer durchgeführt werden.
- Waschen Sie Deckgläser dreimal mit PBS.
- 1 ml 0,2% Triton X-100 für 10 Min. zugeben.
- Waschen Sie Deckgläser dreimal mit PBS.
- 50 μl TRITC Phalloidin (50 μg/ml) für 45 min auf Deckgläser geben.
- Waschen Sie die Deckgläser dreimal, nehmen Sie sie von der 12-Well-Platte und legen Sie sie mit einem weich abbindenden Eindeckmedium, das DAPI enthält, auf einen Objektträger. Versiegeln Sie die Seiten mit Nagellack.
Anmerkung: Dias können einige Monate im Dunkeln gelagert werden. Vermeiden Sie Lichteinstrahlung, um Photobleaching zu verhindern.
- Betrachten Sie Objektträger mit einem konfokalen Mikroskop.
- Verwenden Sie hier ein 34-Kanal-Spektralsystem (32-Kanal-Array-Detektor und zwei seitliche PMT-Detektoren sowie ein Durchlichtdetektor), das um einen AxioObserver-Stativ (invertiert) mit einem motorisierten XY-Tisch herum konfiguriert ist. Das System verfügt über fünf Laser: eine blaue Diode (405 nm), ein mehrlinieniges Argon (458, 488, 514 nm), eine grüne Diode (561 nm), ein rotes HeNe (633 nm) und einen gepulsten 440-nm-Laser. Statten Sie ein Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungssystem mit 2 Hybrid-GaAsP-Detektoren (für FRET-FLIM) aus.
- Detektion der Fluoreszenz von DAPI und TRITC in einem Kanal mit einem Dualband-Filter mit Anregungswellenlängen von 340-380 nm und 540-560 nm und einem Emissionsfilter von 435-485 nm bzw. 570-590 nm. Detektion der Fluoreszenz von BCECF-AM mit einem Filter mit einer Anregungswellenlänge von 440-500 nm und einem Emissionsfilter von 510-590 nm.
Anmerkung: Kontrollen auf BCECF-AM sollten an jedem untersuchten Bakterienstamm durchgeführt werden, um eine ordnungsgemäße Markierung lebensfähiger Bakterien sicherzustellen. Validieren Sie zunächst, dass nicht lebensfähige Bakterien DAPI-positiv und BCECF-negativ sind. Zweitens, sicherstellen, dass lebende Bakterien BCECF-AM zu Fluoreszein BCECF verstoffwechseln können. Variable Konzentrationen der Bakterien oder des BCECF-AM-Farbstoffs müssen möglicherweise getestet werden, um eine optimale Markierung zu gewährleisten.