>1. Kultur, Differenzierung und Validierung von HL-60-Zellen
- Bereiten Sie HL-60-Zellkulturmedien vor, bestehend aus 500 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mit L-Glutamin und 50 mL hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum. Fügen Sie keine Antibiotika hinzu, da dies die Differenzierung der HL-60-Zellen beeinträchtigen kann.
- Für die Vermehrung/Erhaltung von HL-60-Zellen werden 5 x 106 Zellen in 10 ml HL-60-Zellkulturmedien in 75 cm2 belüfteten Kolben bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid (CO2) kultiviert. Passagezellen alle 3-4 Tage, um optimale Zellkonzentrationen aufrechtzuerhalten.
Anmerkung: Die Zellkonzentration sollte 5 x 106/ml nicht überschreiten.
- Erzeugung von Arbeitsbeständen von HL-60-Zellen durch Aliquotierung von ca. 1 x 106 Zellen/ml in HL60-Kulturmedien mit 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) in 1 ml-Kryoröhrchen.
Anmerkung: Arbeitslager können bei -80 °C gelagert werden. Das Hauptmaterial sollte bei -120 °C gelagert werden.
- Differenzieren Sie HL-60-Zellen durch Kultivierung von 1,5 x 107 Zellen in 15 ml HL-60-Zellkulturmedien mit 0,6 % N, N-Dimethylformamid (DMF) bei 37 °C und 5 % CO2 in sterilen 75 cm2-Kolben mit Filterdeckel für 3 Tage vor der opsonophagozytären Abtötungsaktivität (OPKA).
- Validieren, dass die HL-60-Zellen erfolgreich differenziert wurden und für die Verwendung im OPKA-Assay geeignet sind, indem die Viabilitäts- und Zelloberflächenmarker gemäß den etablierten Durchflusszytometrieprotokollen getestet werden. Nach der Differenzierung HL-60-Zellen ernten und ca. 1 x 104 Zellen mit fluoreszierend konjugierten Antikörpern/Färbemitteln für CD71, CD35, Annexin V und Propidiumiodid färben.
Anmerkung: Differenzierte Zellen sollten ≥65 % lebensfähig, ≥55 % CD35+ und ≤20 % CD71+ aufweisen, wie durch etablierte Validierungsprotokolle bestimmt (Abbildung 1).
>2. Vorbereitung von OPKA-Puffern und -Reagenzien
- Bereiten Sie 50 ml sterilen Opsonisationspuffer B (OBB) vor, indem Sie 42,5 ml sterile 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Ca2+/Mg2+, 5 ml hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum und 2,5 ml 0,1 % sterile Gelatine mischen. Bei 4 °C lagern.
- Kaninchenbaby besorgen und bei -80 °C lagern.
- Beschaffen oder Vorbereiten von Bakterienkulturplatten (z. B. 15 x 100 mm2 5 % Agarplatten aus Schafblut).
>3. Vorbereitung von bakteriellen Stammproben
- Besorgen Sie sich einen Vorrat des/der zu testenden Bakterienstämme.
HINWEIS: Für dieses Protokoll wird Streptococcus pneumoniae vom Serotyp 3 (WU2, großzügig zur Verfügung gestellt von Dr. Moon Nahm) verwendet.
- Züchten Sie den Bakterienstamm in einer geeigneten Brühe (d.h. Todd-Hewitt-Brühe + 0,5% Hefeextrakt für diesen WU2-Stamm) für ca. 2-4 h bei 37 °C.
Anmerkung: Die optische Dichte bei 600 nm (OD600) der Kultur sollte zwischen 0,6 und 0,8 liegen.
- Pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 6.000 x g für 2 min und resuspendieren Sie die Zellen in 10-30 mL 15%igem Glycerin in der entsprechenden Brühe. Die Bakterienkultur (500 μl pro Aliquot) in sterile 1,5 mL Zentrifugenröhrchen aliquotieren und bei -80 °C lagern.
- Tauen Sie ein Fläschchen mit Bakterienfond in einem 37 °C warmen Wasserbad auf. Die Bakterienzellen werden pelletiert und in 500 μl OBB unter sterilen Bedingungen resuspendiert.
- Bereiten Sie verschiedene Verdünnungen des Bakterienbestands in OBB vor (d. h. 10 μl ohne Verdünnung, 10 μl mit 1:10, 10 μl mit 1:100 usw.). Der OPKA-Assay (Abschnitte 4–6, einschließlich HL-60/Komplement-Cokultur) ist wie unten beschrieben unter Verwendung verschiedener Verdünnungen des unbehandelten Bakterienbestands durchzuführen. Die Platten über Nacht bei 30 °C (kein CO2) kultivieren.
Anmerkung: Die Temperatur von 30 °C ist spezifisch für WU2, um ein Überwachsen zu verhindern; Andere Stämme/Serotypen können optimal bei 37 °C wachsen.
- Zählen Sie die Kolonien für jede Verdünnung von unbehandeltem Bakterienbestand, der mit HL-60-Zellen und Komplementen co-kultiviert wurde. Bestimmen Sie, welche Verdünnung von Bakterien die optimale Anzahl zählbarer Kolonien ergibt (ca. 80-120 koloniebildende Einheiten (KBE) für unbehandelte Bakterien, die mit HL-60-Zellen co-kultiviert wurden). Beachten Sie diese Verdünnung für zukünftige OPKAs, die diesen Bakterienbestand enthalten.
>4. Bakterielle Behandlung und Kultur
- Tauen Sie ein Röhrchen mit der in Schritt 3.3 vorbereiteten Bakterienbrühe auf. Pelletieren Sie die Bakterien (6.000 x g für 2 min) und resuspendieren Sie das Zellpellet in OBB bei optimaler Verdünnung, wie in Schritt 3.6 bestimmt.
- Pipettieren Sie 10 μl resuspendierte bakterielle Verdünnung pro Vertiefung in einer 96-Well-Zellkulturplatte mit rundem Boden.
- Geben Sie 20 μl eines geeigneten Antikörpers oder einer medikamentösen Behandlung in doppelter Ausfertigung in jede Versuchsvertiefung.
HINWEIS: In diesem Protokoll wird ein in Mäusen erzeugter Serotyp-spezifischer Antikörper als Behandlung X hinzugefügt, und ein Glykosidhydrolase-Enzym, von dem bekannt ist, dass es die Polysaccharidkapsel des Serotyps 3 abbaut, wird als Behandlung Y hinzugefügt (Abbildung 2). Verwenden Sie für Kontrollvertiefungen 1x PBS oder OBB, je nachdem, welcher Puffer für die Aufbereitungsvertiefungen verwendet wird.
- Die Probenplatte wird 1 h lang bei Raumtemperatur bei ca. 90 U/min geschüttelt. Passen Sie diese Bedingungen je nach den optimalen Temperatur- oder Schüttelbedingungen der zu testenden Behandlungen an.
>5. HL-60 bakterielle Co-Kultur
- Bereiten Sie HL-60-Zellen vor, indem Sie die differenzierten HL-60-Zellen, die drei Tage zuvor mit DMF behandelt wurden (siehe Schritt 1.4), in konische 15-ml-Röhrchen ernten. Pelletieren Sie die Zellen (500 x g, 3 min), entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit mindestens 10 mL 1x PBS.
- Pelletieren Sie die gewaschenen Zellen (500 x g, 3 min), verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in OBB (beginnen Sie mit 1 mL OBB und stellen Sie nach der Zellzählung eine Endkonzentration von 1 x 107/ml ein).
- Geben Sie Baby Rabbit Supplement (steriles, unverdünntes Baby-Kaninchen-Serum, Alter 3-4 Wochen) in einem Endvolumen von 1:5 zu.
Anmerkung: Die Endkonzentration des HL-60-Komplementgemisches sollte 1 x 107/ml betragen. Bei der Prüfung der Komplementabhängigkeit kann eine zweite Lösung verwendet werden, die aktive HL-60-Zellen mit hitzeinaktiviertem Komplement enthält (das Komplement kann durch Inkubation in einem Wasserbad bei >55 °C für mindestens 30 min inaktiviert werden).
- Nachdem die Bakterienkultur 1 Stunde lang abgeschlossen ist (Schritt 4.4), teilen Sie jede Probe (d. h. 10 μl jeder 30-μl-Probenvertiefung in zwei neue Vertiefungen) in doppelte Vertiefungen für zwei Gruppen auf (d. h. verwenden Sie nur 20 μl der ursprünglichen 30 μl-Cokultur, um Pipettierfehler zu berücksichtigen): Ein Satz wird mit HL-60-Komplement co-kultiviert und einer enthält nur Bakterien. 50 μl des HL-60-Komplementgemisches (aus Schritt 5.3) werden in jeden Versuchssatz von Vertiefungen (delegiert +HL-60) gegeben; Geben Sie 50 μl OBB allein in die Vertiefungen der Bakterien (delegiert -HL-60).
Anmerkung: Für dieses Beispiel werden ca. 800 bakterielle KBE für die initiale Co-Kultur mit 5 x 105/50 μL HL-60 Zellen verwendet. Wenn diese Multiplizität der Infektionen zu hoch oder zu niedrig ist, wie aus den endgültigen Koloniezahlen hervorgeht, passen Sie die anfängliche Bakterienverdünnung im Gegensatz zur HL-60-Zellzahl an.
- Schütteln Sie die 96-Well-Platte 1 h lang bei 37 °C (ohne CO2).
>6. Probenbeschichtung und Inkubation über Nacht
- Verdünnen Sie jede Vertiefung 1:5 mit OBB, so dass jede Probe ein Volumen von mindestens 50 μL hat.
- Pipettieren Sie 50 μl jeder Probe direkt auf einen bestimmten Bereich einer Bakterienkulturplatte, wobei ein ausreichender Abstand zwischen den Proben gewährleistet ist. Für 15 x 100 mm2 runde Agarplatten pipettieren Sie ca. 4 Proben auf eine Platte.
- Die Proben abdecken und ca. 15 Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen.
- Platten umdrehen und über Nacht bei 30 °C (kein CO2) kultivieren. Alternativ können Kulturplatten in anaeroben Gläsern verwendet werden, um zu testen, ob anoxische Bedingungen das Bakterienwachstum beeinflussen, oder um die Morphologie zu kontrollieren.
- Zählen Sie nach der Kultur über Nacht die Völker in jedem ausgewiesenen Probenbereich. Analysieren Sie die Daten, indem Sie die Anzahl der lebenden Zellen in jedem Satz mit den entsprechenden Kontroll- und/oder Proben, die keine HL-60-Zell-Cokultur erhalten (Indikator für 100 % Zellüberleben, 0 % Zelltötung).
