Beurteilung von internalisiertem Porphyromonas gingivalis in Endothelzellen des Wirts

Zusammenfassung

Quelle: Wunsch, C. M., et al. Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus zur Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen. J. Vis. (2015)

In diesem Video demonstrieren wir einen Assay zur Beurteilung des Überlebens von Porphyromonas gingivalis in menschlichen Endothelzellen. Das Maß für das Überleben und Wachstum von internalisiertem Porphyromonas gingivalis wird anhand der Anzahl der Kolonien auf der Blutagarplatte bewertet.

Protokoll

>1. Überleben internalisierter Bakterien.

1. Bereiten Sie die anaeroben Bakterien von P. gingivalis vor, bis sie das mittlere Wachstum (OD₆₆₀ 0,5-0,7) erreichen.
2. Bakterien bei 5.000 x g für 10 min zentrifugieren.
3. Setzen Sie pelletiertes P. gingivalis wieder in die Kammer ein und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie es mit PBS und pelletieren Sie die Bakterien erneut, bevor Sie es in VEGF-Medien resuspendieren. Bereiten Sie Suspensionen für alle zu testenden Bakterienstämme bei OD₆₆₀ von 0,7 vor, was der Mid-Log-Phase (~7 x 10,⁸ Zellen/ml) entspricht. Die Bakterien sind nun bereit für eine Infektion.
4. Übertragen Sie 6-Well-Platten mit HUVECs aus dem Gewebekultur-Inkubator in die anaerobe Kammer. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es dreimal mit anaerobem PBS. Geben Sie 2 ml anaerobes VEGF-Medium in jede Vertiefung und stellen Sie die Platten bei 37 °C für 20 Minuten in den anaeroben Inkubator, um die Temperatur für die Infektion auszugleichen.
5. Infizieren Sie Wirtszellen mit Bakterien bei einer Infektionsvielfalt (MOI-Bakterien: Wirt) von 100:1,
   Anmerkung: Die HUVEC-Zellzahl wird bestimmt, indem vor der Infektion ein Trypan-Ausschlusstest an einer einzelnen Vertiefung durchgeführt wird. Die bakterielle Zellzahl wird über die optische Dichte bestimmt (z.B. OD von 0,5 = 5 x 10⁸ Zellen/ml). Die Bakterienkonzentration wird auf der Grundlage der HUVEC-Konzentration an den richtigen MOI angepasst.
6. Legen Sie 6-Well-Platten mit infizierten HUVECs in einen anaeroben Inkubator und lassen Sie die Bakterien 30 Minuten lang mit den Wirtszellen interagieren.
7. Bereiten Sie Saponin in BHI (1,0 % w/v) in der anaeroben Kammer vor und filtrieren Sie durch einen 0,2 μm Filter.
8. Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator. Waschen Sie dreimal mit anaerobem PBS und fügen Sie 2 ml VEGF-Medium mit einem ergänzten Antibiotikum (300 μg/ml Gentamicin und 400 μg/ml Metronidazol) hinzu.
9. 1 Stunde inkubieren. Achten Sie darauf, die Antibiotika so zu testen, dass sie den gewünschten Bakterienstamm zu 100 % abtöten, und stellen Sie sicher, dass sie nicht in die Wirtszellen eindringen.
10. Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 2 ml filtriertes 1,0 % Saponin hinzu. 15 Minuten inkubieren, um die Lyse der Wirtszellen zu ermöglichen.
11. Kratzen Sie den Boden jeder Vertiefung mit einem Zellschaber ab. Sammeln Sie die Zellmischung aus jeder Vertiefung und verdünnen Sie sie 1:1 in BHI.
12. Bereiten Sie serielle Verdünnungen der Probe vor (1:100, 1:1.000).
13. Platte 200 μl der gewünschten Verdünnung auf Blut-Agar-Platten. Wickeln Sie die Platten in Parafilm ein und legen Sie sie in einen anaeroben Inkubator.
14. Nach siebentägiger Inkubation bei 37 °C sind die Platten zu entfernen und die KBE zu zählen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anaerobe Vinylkammer-Typ B	Coy Laborprodukte		Inkubator Modell 2000
TSA II Trypticase Soja-Agar mit 5% Schafsblut	BBL	221261
Humane Nabelvenen-Endothelzellen Pool für 10 Spender	LifeLine-Technologie	Nr. FC-0044
VascuLife VEGF Medium Komplettset	LifeLine-Technologie	LL-0003
TrypKit	Rettungsleine	LL-0013
saponin	Riedel-de Haen	Artikel-Nr.: 16109
Gentamicinsulfat-Salz	Sigma-Aldrich	G-1264
metronidazol	Sigma-Aldrich	Nr. M-3761