Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Expression und Reinigung von Antikörpern
- Erhaltung der Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO)
- Züchten Sie CHO-Zellen in FreeStyle CHO Media, ergänzt mit handelsüblichem 1x Glutamin-Präparat bei 37 °C, Schütteln bei 130 U/min mit 5% CO2 unter Verwendung von langen Erlenmeyerkolben, entweder Glas oder Einwegkolben.
Anmerkung: Es wird dringend empfohlen, einen Kolben mit Blende und belüfteter Kappe zu verwenden, um die Bewegung zu erhöhen und die Gasübertragung unter Schüttelbedingungen zu verbessern. Eine signifikant reduzierte Antikörperausbeute wurde mit normalen Kolben (ohne Blende) aufgrund der begrenzten Bewegung der Suspensionskultur erzielt.
- Halten Sie die Zellzahl zwischen 1-5 x 106 Zellen/ml mit >95% Zellviabilität. Wenn die Zellzahl über 5 x 106 Zellen/ml zunimmt, teilen Sie die Zellen. Lassen Sie die CHO-Zellen niemals unter 0,2 x 106 Zellen/ml fallen.
- Transfektion von CHO-Zellen
- Züchten Sie CHO-Zellen in 200 mL Medium (2 x 106 Zellen/ml) in langen Erlenmeyerkolben mit Blende.
Anmerkung: Suspensionskulturen, die in Kolben ohne Kolben gezüchtet wurden, haben immer höhere Proteinerträge erzielt als in Kolben ohne Kolben.
- Nehmen Sie in einem 15-ml-Röhrchen 5 ml CHO FreeStyle-Medien und fügen Sie 50 μg VH-Klon-DNA und 75 μg VL-Klon-DNA hinzu. Vortex, um gut zu mischen.
- Inkubieren Sie das DNA-Gemisch bei Raumtemperatur für 5 min.
Anmerkung: Eine längere Inkubation reduziert die Proteinausbeute.
- Geben Sie 750 μl 1 mg/ml Polyethylenimin (PEI)-Stamm in die DNA-Lösung und wirbeln Sie die Mischung 30 s lang aggressiv ein. Inkubieren Sie weitere 5 Min. bei Raumtemperatur< >
Anmerkung: PEI muss frisch hergestellt werden. Mehrere Gefrier-Tau-Zyklen von PEI reduzieren den Gesamtertrag erheblich.
- Geben Sie die gesamte Mischung aus DNA und PEI in die Zellen, während Sie den Kolben manuell schütteln. Die Delong-Erlenmeyerkolben mit Schwallkolben werden sofort bei 37 °C inkubiert und bei 130 U/min geschüttelt.
- Ausdruck
Anmerkung: Der Antikörper verfügt über ein sekretorisches Signalpeptid, das bis zu seinem N-terminalen Ende entwickelt wurde und dazu beiträgt, dass Antikörper in das Medium sezerniert werden.
- Züchten Sie die transfizierten Zellen bei 37 °C und schütteln Sie sie an Tag 1 bei 130 U/min.
- Fügen Sie an Tag 2 2 ml 100x Anti-Klumpen-Mittel und 2 ml 100x antibakteriell-antimykotische Lösung hinzu. Den Kolben auf eine niedrigere Temperatur (32-34 °C) stellen und bei 130 U/min schütteln.
- Fügen Sie an jedem fünften Tag 10 ml Trypton N1-Futter und 2 ml 100x Glutamin-Ergänzungsmittel hinzu.
- Zählen Sie die Zellen jeden dritten Tag mit einem Hämozytometer, nachdem Sie ein Aliquot von Zellen mit einem Trypanblau-Fleck gefärbt haben. Stellen Sie sicher, dass die Zellviabilität über 80 % bleibt.
- Ernten Sie am 10. oder 11. Tag das Medium für die Antikörperreinigung. Schleudern Sie die Kultur bei 3000 x g, 4 °C für 40-60 min und filtrieren Sie dann das klare Medium mit 0,22 μM Flaschenfiltern.
- Reinigung
Anmerkung: Die Antikörperaufreinigung wird mit einer kommerziell erhältlichen Protein-A-Säule (siehe Materialtabelle) unter Verwendung einer Peristaltikpumpe durchgeführt.
- Die Säule wird mit dem zweispaltigen Volumen des Bindungspuffers (20 mM Natriumphosphat bei pH 7,4) äquilibriert.
- Das filtrierte Medium, das Antikörper enthält (erhalten in Schritt 1.3.5), wird mit einer Flussrate von 1 ml/min durch die Säule geleitet.
- Waschen Sie die Säule mit dem zweispaltigen Volumen des Bindungspuffers.
- Eluieren Sie den Antikörper in 500-μl-Fraktionen mit 5 ml-Elutionspuffer (30 mM Natriumacetat bei pH 3,4).
- Neutralisieren Sie den pH-Wert des eluierten Antikörpers durch Zugabe von 10 μl Neutralisationspuffer (3 M Natriumacetat bei pH 9) pro Fraktion.
Anmerkung: Die Fraktion Nummer 3-6 enthält den größten Teil des Antikörpers. Es ist ratsam, alle Fraktionen aufzubewahren, falls der Antikörper in einer späteren Fraktion als erwartet eluiert wird.
- Messen Sie die Konzentration von gereinigten Antikörpern mit einem Spektralphotometer, indem Sie das Standardprotokoll für Immunglobulin G (IgG) auswählen. Die endgültige Konzentration des Antikörpers wird unter Berücksichtigung des Molekulargewichts und des Absorptionskoeffizienten in mg/ml ermittelt.
>2. Fluoreszierende Markierung
HINWEIS: Antikörper werden mit dem Infrarotfarbstoff markiert, der eine reaktive NHS-Estergruppe enthält, die an Proteine koppelt und ein stabiles Konjugat bildet. Diese Reaktion ist pH-empfindlich und funktioniert am besten bei pH 8,5. Fluoreszierende Konjugate, die mit dem Farbstoff markiert sind, weisen ein Absorptionsmaximum von 774 nm und ein Emissionsmaximum von 789 nm auf. Ein pH-Wert von 8,5 ist der Schlüssel für eine effektive Konjugation.
- 0,5 ml des Antikörpers werden mit einer Dialysekassette (0,1-0,5 ml) in 1 l Konjugationspuffer (50 mM Phosphatpuffer bei pH 8,5) dialysiert. Nach 4 h die Dialysekassette in einen frischen Puffer umfüllen und über Nacht dialysieren.
- Richten Sie eine Konjugationsreaktion ein, indem Sie 0,03 mg IRDye 800CW pro 1 mg Antikörper in einem Reaktionsvolumen von 500 μl.
Anmerkung: IRDye 800CW ist in DMSO in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst.
- Beschriftungsreaktionen 2 h lang bei 20 °C durchführen.
Anmerkung: Eine Erhöhung der Zeit über 2 Stunden hinaus verbessert die Beschriftung nicht.
- Reinigen Sie markierte Konjugate durch extensive Dialyse gegen 1x PBS.
- Schätzen Sie den Grad der Markierung, indem Sie die Absorption des Farbstoffs bei 780 nm und die Absorption des Proteins bei 280 nm messen. Der Farbstoffanteil am 280-nm-Signal beträgt 3 %.
- Berechnen Sie das Farbstoff/Protein-Verhältnis mit dieser Formel:
wobei 0,03 ein Korrekturfaktor für die Extinktion des bei 280 nm verwendeten Farbstoffs ist (entspricht 3,0 % seiner Extinktion bei 780 nm), sind εDye und εProtein molare Extinktionskoeffizienten für den Farbstoff bzw. das Protein (Antikörper).
HINWEIS: εFarbstoff beträgt 270.000 M-1 cm-1 und εProtein ist 203.000 M-1 cm-1 (für ein typisches IgG) in einer 1:1-Mischung aus PBS:Methanol. Andere Proteine als IgG können sehr unterschiedliche molare Extinktionskoeffizienten haben. Die Verwendung des korrekten Extinktionskoeffizienten für das interessierende Protein ist für die genaue Bestimmung des D/P-Verhältnisses unerlässlich.
- Berechnen Sie die endgültige Proteinkonzentration mit dieser Formel:
Anmerkung: Bestätigen Sie die antigenbindende Wirksamkeit von markierten und unmarkierten Antikörpern immer mittels ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) oder Durchflusszytometrie, bevor Sie mit In-vivo-Studien fortfahren.
>3. Studien an Maus-Xenotransplantaten
- Vorbereitung von Tumorzellen für die Injektion
- Züchten Sie OVCAR-3-Zellen in RPMI-1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS und 1x Penicillin-Streptomycin.
- Am Tag vor der Injektion werden die Zellen in neue 100-mm-Kulturschalen mit 10 ml des kompletten Mediums/der Schale subkultiviert. Verwenden Sie eine Zellzahl von 0,5-1 x 106 Zellen/Schale.
- Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 °C Temperatur, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für 20-24 Stunden.
- Entfernen Sie am Tag der Injektion das Nährmedium aus den Kulturschalen. Spülen Sie die Zellschicht gründlich mit Ca2+/Mg2+ freier Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS), um abgestorbene Zellen, Zelltrümmer und alle Spuren von Serum zu entfernen, die die Wirkung von Trypsin beeinträchtigen könnten.
- Trypsinisieren Sie die Zellen, indem Sie 1,0-1,5 ml Trypsin-EDTA-Lösung in jede Schale geben und versuchen, die Lösung zu verteilen, indem Sie die Schale rundherum kippen, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C für 5-10 min.
Anmerkung: Beobachten Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop, um den tatsächlichen Trypsinisierungsstatus zu überprüfen. Eine Untertrypsinisierung führt zu einer geringeren Anzahl von Zellen, die sich von der Oberfläche der Kulturschale lösen, eine Übertrypsinisierung induziert zellulären Stress. Daher ist die richtige Trypsinisierung wichtig.
- Geben Sie 1,0-1,5 ml vollständiges Wachstumsmedium in jede Schale, um die Trypsinwirkung zu stoppen, und resuspendieren Sie die Zellen anschließend durch vorsichtiges Pipettieren.
Anmerkung: Schonendes Pipettieren ist wichtig, um die Zellgesundheit zu erhalten.
- Sammeln Sie die Zellsuspension in einem konischen 15-ml-Röhrchen und schleudern Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 250 x g.
- Sammeln Sie das Zellpellet nach Entfernen des Überstands und waschen Sie die Zellen, indem Sie das Pellet in 1x DPBS wieder aufwirbeln.
- Schleudern Sie die Zellsuspension bei niedriger Geschwindigkeit von 250 x g für 5 min.
- Fügen Sie 500 μl DPBS hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
- Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
Anmerkung: Für eine bessere Genauigkeit wiederholen Sie die Zählung dreimal und nehmen Sie einen Mittelwert.
- Stellen Sie das Volumen so ein, dass die endgültige Zelldichte 1 x 108 Zellen/ml beträgt.
- Subkutane Injektion von Zellen zur Entwicklung von Maus-Xenotransplantaten
Anmerkung: Alle Eingriffe sollten in einer BSL2-Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. In der aktuellen Studie wurden Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ Mäuse verwendet.
- 50 μl der Zellsuspension in ein 1,5 ml-Röhrchen geben und mit 50 μl Basalmembran-Matrixmedium mischen.
Anmerkung: Das Basalmembran-Matrixmedium neigt dazu, bei Raumtemperatur einen gelartigen Zustand zu bilden, halten Sie die Zellen und die Mischung des Matrixmediums daher sorgfältig auf Eis. Es ist ratsam, Röhrchen, Spitzen und Spritzen im Kühlschrank aufzubewahren und sie dann vor der Tierinjektion auf Eis zu legen.
- Rühren Sie die Mischung um, um ein Verklumpen der Zellen zu vermeiden. Nehmen Sie dann diese 100 μl des Zellsuspensions-Matrix-Medium-Gemisches, das 5 x 106 Zellen enthält, in eine 1-cm³-Spritze.
- Heben Sie die Haut des Tieres vorsichtig an, um die Haut von der darunter liegenden Muskelschicht zu trennen, und injizieren Sie die Zellsuspension (100 μL) langsam mit einer 26 G Nadel unter die Haut (5 x 106 Zellen). Warten Sie einige Sekunden, bevor Sie die Nadel herausnehmen, damit das Basalmatrixmedium zusammen mit den Zellen unter der Haut die halbfeste gelartige Struktur bilden kann und verhindert, dass das Gemisch aus der Injektionsstelle austritt.
Anmerkung: Die Zellen müssen vor der Injektion auf Kontaminationen getestet werden, die immundefiziente Mäuse schädigen könnten. Führen Sie die Nadel während der Injektion nicht zu tief in die Haut ein, da dies den Tumor tiefer als erwartet bilden kann.
- Halten Sie das Tier in einem sterilen Käfig und beobachten Sie es etwa 20 Minuten lang.
- Beobachten Sie die Mäuse 2-3 Wochen lang und lassen Sie den Tumor bis zu 500 mm3 groß werden.
>4. Antikörperlokalisierung mit einem in vivo Bildgebungssystem
HINWEIS: In-vivo-Bildgebungsgeräte (siehe Materialtabelle), die in diesem Experiment verwendet werden, verwenden einen Satz hocheffizienter Filter und spektraler Entmischungsalgorithmen zur nicht-invasiven Visualisierung und Verfolgung der zellulären und genetischen Aktivität innerhalb eines lebenden Organismus in Echtzeit. Das System bietet sowohl Fluoreszenz- als auch Biolumineszenzüberwachungsfunktionen.
- Injizieren Sie 25 μg des farbstoffmarkierten Antikörpers über die Schwanzvene.
- Betäuben Sie tumortragende Mäuse mit 2 % Isofluran. Überprüfen Sie, ob die Pedalreflexe nicht reagieren.
- Sobald sich die Mäuse nicht mehr bewegen, erweitern Sie die seitliche Schwanzvene, indem Sie Wurmwasser auftragen.
- Injizieren Sie 25 μg (in 100 μl) markierten Antikörper mit einer 1-cm³-Insulinspritze und einer 26-g-Nadel.
- In ähnlicher Weise wird als Negativkontrolle der unspezifische Antikörper des IgG1-Isotyps, der nicht auf Krebszellen abzielt, markiert und injiziert.
- Durchführung von In-vivo-Live-Bildgebung nach 8, 24, 48 Stunden usw. von Antikörperinjektionen.
- Klicken Sie in der zugehörigen Software in der Systemsteuerung auf Initialisieren und bestätigen Sie, dass die Tischtemperatur 37 °C beträgt.
- Schalten Sie die Sauerstoffzufuhr, alle Pumpen des Anästhesiesystems und die Isoflurangaszufuhr zur Anästhesiekammer ein und stellen Sie das Isofluran-Verdampferventil auf 2 % ein.
- Bringen Sie die Mäuse in die Narkosekammer und warten Sie, bis die Mäuse vollständig betäubt sind. Tragen Sie die Augenschmiersalbe auf, um ein Austrocknen der Augen zu vermeiden.
- Gehen Sie zur Systemsteuerung, richten Sie die Fluoreszenzbildgebung über die Option Bildgebungsassistent ein und wählen Sie die Anregung bei 773 nm und die Emission bei 792 nm aus.
Anmerkung: Die Standardeinstellungen für die automatische Belichtung sorgen für ein gutes fluoreszierendes Bild. Die Einstellungen für die automatische Belichtung können jedoch je nach Bedarf geändert werden.
- Bringen Sie die anästhesierten Mäuse in die Bildgebungskammer und bauen Sie sie mit einem Nasenkonus auf dem Bildgebungsfeld zusammen. Der Bildgebungstisch bietet die Möglichkeit, 5 Mäuse gleichzeitig aufzunehmen.
Anmerkung: Lassen Sie Kontrollmäuse zusammen mit den Testmäusen abbilden, um während der Analyse eine ähnliche Belichtungsmenge und andere Einstellungen zu erzielen.
- Wenn alles fertig ist, wählen Sie auf dem Bedienfeld die Option Erfassen für die Bildaufnahme.
- Mit den Einstellungen für die automatische Belichtung generiert das System das Bild innerhalb einer Minute. Das erzeugte Bild ist die Überlagerung der Fluoreszenz auf dem fotografischen Bild mit der optischen Fluoreszenzintensität, die in Einheiten von Zählungen oder Photonen oder Effizienzbegriffen angezeigt wird.
- Nachdem Sie das Bild aufgenommen haben, bringen Sie die Mäuse aus der Bildgebungskammer zurück in ihren Käfig und beobachten Sie ihre Genesung 1 bis 2 Minuten lang.
- Optimieren Sie das Bild weiter mit den Werkzeugen und Funktionen, die in der Software für die Bildanalyse bereitgestellt werden. Bildanalysewerkzeuge befinden sich in der Menüleiste und in der Werkzeugpalette.
- Passen Sie unter Bildanpassung die Helligkeit, den Kontrast oder die Deckkraft an und wählen Sie die Farbskala aus.
- Verwenden Sie die ROI-Tools, um einen Region of Interest (ROI) in einem optischen Bild anzugeben und die Signalintensität innerhalb des ROI zu messen. Exportieren Sie bei Bedarf die quantifizierten Signaldaten in eine Tabellenkalkulationssoftware und stellen Sie die Daten grafisch dar.
- Analysieren Sie für Folgestudien die Sektion von Mäusen verschiedener Gewebe (z. B. Leber, Lunge, Herz, Niere, Milz, Gehirn usw.) nebeneinander, um eine detaillierte unspezifische Verteilung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern zu erhalten.
Anmerkung: Die Daten können durch die Verwendung von Antigen (in diesem Fall FOLR1) in 96-Well-Assays weiter mit gewebespezifischem ELISA untermauert werden.
