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>1. Durchflusszytometrische Färbung von Mtb-infizierten Monozyten-abgeleiteten Zellen
HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen in einer BSL-3-Einrichtung durchgeführt werden. Die durchflusszytometrische Färbung konnte in einer 96-Well-Platte anstelle von Röhrchen durchgeführt werden.
- Das Mycobacterium tuberculosis, die Mtb-infizierten Zellen (und die nicht infizierten Kontrollen) werden durch Inkubation mit 1 ml FACS-Puffer pro Vertiefung für mindestens 30 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2 aus den Vertiefungen in der/den 6-Well-Platte(n) entfernt.
- Pipettieren Sie einige Male vorsichtig auf und ab, um sicherzustellen, dass sich die Zellen lösen. Wenn möglich, bestätigen Sie die Zellablösung mit dem Mikroskop. Übertragen Sie die Zellsuspension aus jeder Vertiefung in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss und drehen Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei 200 x g. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig durch Pipettieren.
- Waschen Sie das Zellpellet in jedem Röhrchen zweimal mit FACS-Puffer und schleudern Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min.
- Färben Sie die Zellen (ca. 0,5 x 106 bis 1 x 106 Zellen/Röhrchen) mit ca. 50 μL Cocktail aus Fluorochrom-konjugierten Anti-Human-Antikörpern einschließlich TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Dazzle 594), HLA-DR (PE-Cy5) (Tabelle 1) in Kombination mit dem Viabilitätsfarbstoff Zombie-UV für 30 min bei 4 °C (Kühlschrank) im Dunkeln.
- Waschen Sie die gefärbten Zellen zweimal mit 400 μl FACS-Puffer und schleudern Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min.
- Fixieren Sie die gefärbten Zellen mit 200 μl Fixierungspuffer (frisch zubereitet) für 30 min bei RT im Dunkeln, um eine vollständige Inaktivierung der Mykobakterien zu gewährleisten.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit 400 μl FACS-Puffer und schleudern Sie sie 5 Minuten lang bei 200 x g, um überschüssigen Fixpuffer zu entfernen.
- Resuspendieren Sie die fixierten Zellen in 400 μl FACS-Puffer und überführen Sie die Proben in neue 1 mL Mikrozentrifugenröhrchen, bevor Sie sie aus dem BSL-3-Labor für die Durchflusszytometrie in BSL-2 nehmen. Lagern Sie die gefärbten Zellen bis zur Probenaufnahme bei +4 °C.
Anmerkung: Besprühen Sie die Röhrchen mit 70%igem Ethanol, bevor Sie sie aus dem BSL-3-Labor nehmen. Formaldehyd ist giftig (krebserregend) und muss in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II gehandhabt werden. Entsorgen Sie Formaldehydabfälle in einem separaten chemischen Abfall.
>2. Durchflusszytometrische Datenerfassung und Analyse von Mtb-infizierten Monozyten-abgeleiteten Zellen
HINWEIS: Die Schritte 2.1–2.2 sollten vor der oben beschriebenen Durchflusszytometrie-Färbung durchgeführt werden. Um Probleme mit der Zellverklumpung und Dissoziation von Tandemfarbstoffen nach der Zellfixierung zu vermeiden, erfolgt die Probenentnahme sowohl von Mtb-infizierten als auch von nicht infizierten Zellen innerhalb von 4-10 Stunden nach der primären Antikörperfärbung.
- Vor der oben beschriebenen Durchflusszytometrie-Färbung ist das Fluoreszenzsignal für jeden Fluorochrom-konjugierten Antikörper, der in der Färbetafel aufgeführt ist (Tabelle 1), mit Kompensationskügelchen (sowohl positiv als auch negativ) zu kompensieren.
- Titrieren Sie die Antikörperverdünnung für die Färbung menschlicher Makrophagen, um das optimale Signal für jedes Fluorochrom zu erhalten.
- Verwenden Sie ungefärbte Zellen, um den Grad der Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen, der erforderlich ist, um ein Gate für die negative Zellpopulation zu setzen, damit die gefärbten Zellen sichtbar gemacht werden können (Makrophagen sind stark autofluoreszierend).
- Erfassen Sie mindestens 50.000 Zellen/Probe im Durchflusszytometer mit der empfohlenen Software für die Datenerfassung.
- Exportieren Sie die Erfassungsdateien aus dem Durchflusszytometer im FCS-Format (Flow Cytometry Standard) 3.1.
- Analysieren Sie die FCS-Dateien in einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware.
- Gate Makrophagen entsprechend ihren Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften (FSC und SSC) und schließen tote Zellen durch Lebend-/Totzell-Gating mit dem Zombie-UV-Viabilitätsfarbstoff aus.
- Visualisieren Sie H37Rv-GFP-infizierte Makrophagen im FITC-Kanal.
- Identifizieren Sie die Häufigkeit positiv gefärbter Zellen und die geometrische mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für alle Marker (Tabelle 1).
Tabelle 1: Liste der Antikörper, die für die Durchflusszytometrie verwendet werden.
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| Laser | Filter | Fluorochrom | Phänotyp | Funktion | klonen | Katalog-Nr. | Firma |
| 639 | 670/30 | Nr. AF647 | TLR2 | Rezeptor zur Erkennung von Krankheitserregern | TL2.1 | 309714 | BioLegende |
| 639 | 780/60 | APC-CY7 | Nr. CD206 | Mannose-Rezeptor | 15-2 | Artikel-Nr.: 321120 | BioLegende |
| Nr. 405 | Nr. 610/20 | BV605 | Nr. CD163 | Scavenger-Rezeptor | WHI/61 | 333616 | BioLegende |
| Nr. 405 | 670/30 | BV650 | CD80 | Co-stimulierendes Molekül | 2W10 | 305227 | BioLegende |
| Nr. 405 | 710/50 | BV711 | CCR7 | Chemokin-Rezeptor | Nr. G043H7 | 353228 | BioLegende |
| Nr. 405 | 780/60 | BV785 | CD86 | Co-stimulierendes Molekül | IT2.2 | 305442 | BioLegende |
| 488 | Nr. 530/30 | GFP | Mtb | Intrazelluläre Bakterien | | | |
| Nr. 561 | Nr. 586/15 | Pe | CD200R | Hemmender Rezeptor | OX-108 | 329306 | BioLegende |
| Nr. 561 | Nr. 620/14 | PE/BLENDE 594 | CD64 | Fc-Gamma-Rezeptor-I von IgG | 10.1 | 305032 | BioLegende |
| Nr. 561 | Nr. 661/20 | PE-Cy5 (PC5) | HLA-DR | MHC-Molekül der Klasse II | Nr. L243 | 307608 | BioLegende |
| 355 | 450/50 | BUV395 | Viabilitäts-Farbstoff | Marker für lebende/tote Zellen | Zombie UV | 423108 | Invitrogen |