Ein In-vitro-Assay zur Untersuchung der zytotoxischen Fähigkeit von Zytokin-induzierten Killerzellen

Zusammenfassung

Quelle: Hsiao, C. H., et al. Isolierung und Expansion von zytotoxischen Zytokin-induzierten Killer-T-Zellen für die Krebsbehandlung. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video demonstriert eine in vitro Technik, um die zytotoxische Fähigkeit von Zytokin-induzierten Killerzellen (CIK) gegen Krebszellen zu messen. Bei der Co-Kultivierung von Zielkrebszellen mit CIK-Zellen werden die toten Krebszellen mit einem fluoreszierenden Viabilitätsfarbstoff identifiziert und mittels Durchflusszytometrie quantifiziert, um die zytotoxische Wirkung von CIK-Zellen abzuschätzen.

Protokoll

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

>1. Vorbereitung der Materialien

1. Lagern Sie Reagenzien, Antikörper und Chemikalien wie im Sicherheitsdatenblatt (MSDS) gezeigt. Die Arzneimittel oder Zytokine werden in Lösungsmitteln als Stammlösungen gelöst und anschließend für die Lagerung bei -20 °C oder -80 °C aliquotiert.
   Anmerkung: Detaillierte Informationen zur Materialaufbereitung finden Sie in der Materialtabelle.

>2. Isolierung mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC)

1. Erwärmen Sie die Dichtegradientenlösung (Materialtabelle) vor Gebrauch auf 18–20 °C. Drehen Sie die Lösungsflasche mehrmals um, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten.
2. Entnehmen Sie 3-5 ml humane venöse Blutproben in einem heparinisierten Fläschchen und mischen Sie gut, indem Sie das Röhrchen mehrmals vorsichtig umdrehen.
3. Bereiten Sie 4 ml Dichtegradientenlösung in einem sterilen 15-ml-Röhrchen vor.
4. Schichten Sie vorsichtig 1 ml der Blutprobe auf die Dichtegradientenlösung.
5. Zentrifugieren bei 400 x g für 30 min bei 18−20 °C (Pause ausschalten).
6. Aspirieren Sie vorsichtig und sofort die Buffy-Coat-Schicht aus mononukleären Zellen (ca. 1 ml) auf einmal, um eine Störung der Schichten in einem sterilen 15-ml-Röhrchen mit einer sterilen 1-ml-Pipette zu vermeiden.
7. Geben Sie mindestens 3 Volumen (~3 ml) phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in das Buffy-Coat im Zentrifugenröhrchen. Suspendieren Sie die Zellen, indem Sie sie mindestens 3x vorsichtig mit einer sterilen Pipette auf und ab pipettieren.
Bei
8. 400 x g für 10 min bei 18−20 °C zentrifugieren. Der Überstand wird abgesaugt.
9. Das Küvettenpellet wird mit 5 mL Basalmedium suspendiert (Materialtabelle) und in einen Kolben überführt. Kultivieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂.

>3. CIK-Induktion und -Erweiterung

1. An Tag 0 werden die PBMCs (1 x 10⁶) in frischem Basalmedium mit 1.000 I.E./ml IFN-γ 24 h lang in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ kultiviert.
2. An Tag 1 wird das Medium mit frischem Basalmedium aufgefrischt, das 50 ng/ml Anti-CD3-Antikörper, 1 ng/ml rekombinantes humanes (rh) IL-1α und 1.000 U/ml rh IL-2 enthält. Frischen Sie das Medium alle 3 Tage auf.
3. An Tag 7 wird das Medium mit frischem Basalmedium aufgefrischt, das 1.000 U/ml rh IL-2 enthält. Frischen Sie das Medium alle 3 Tage bis zum Ende der Zellexpansion (Tag 14) auf.

>4. Immunphänotypisierung zur Beurteilung von CIK-Zellen

1. Waschen Sie die CIK-Zellen mit 10 mL sterilem PBS. 10 min bei 300 x g und 18-20 °C zentrifugieren, den Überstand aspirieren und die Zellen mit 10 mL PBS resuspendieren. Zählen Sie die Zellzahl und testen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit dem Trypanblau-Ausschluss-Assay.
2. Aliquotieren Sie die CIK-Zellen in sechs sterile 1,5-ml-Röhrchen mit einer Dichte von ~5–10 x 10⁵ Zellen/ml PBS. Etikettieren und wie folgt behandeln: Röhrchen 1, Leerprobe (kein Antikörper); Röhrchen 2: 20 μl Isotyp IgG1-FITC zugeben; In Röhrchen 3 werden 20 μl mAbs des Isotyps IgG1-APC zugegeben; Röhrchen 4, fügen Sie 20 μl CD3-FITC hinzu; Röhrchen 5, fügen Sie 20 μl CD56-APC mAbs hinzu; und Röhrchen 6 fügen Sie 20 μl CD3-FITC und 20 μl CD56-APC mAbs hinzu.
3. Mischen Sie die CIK-Zellen vorsichtig mit den Antikörpern, indem Sie sie mindestens 3x mit einer sterilen 1-ml-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren und dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
4. Die Röhrchen werden 10 min lang bei 300 x g und 18−20 °C zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und das Küvettenpellet einmal mit 1 mL PBS suspendiert. Pipettieren Sie sie mindestens 3x vorsichtig mit einer sterilen 1-ml-Pipette auf und ab.
5. Wiederholen Sie Schritt 4.4.
6. Lassen Sie die Röhrchen vor der durchflusszytometrischen Analyse im Dunkeln.

>5. Erkennung von CD-Markern

1. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit einer Zellsiebkappe (100 μm Netz), indem Sie sie vorsichtig durch die Kappe pipettieren. Lege die Röhren der Reihe nach auf das Karussell.
2. Öffnen Sie die Durchflusszytometrie-Analysesoftware und erstellen Sie einen experimentellen Ordner. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Probe, um dem Experiment eine Probe und ein Röhrchen hinzuzufügen, und benennen Sie die Röhrchen wie folgt: Röhrchen 1, leer; Röhrchen 2, Isotyp IgG1-CD3; Röhrchen 3, Isotyp IgG1-CD56; Röhre 4, CD3; Röhre 5, CD56; Röhre 6, CD3CD56.
3. Erstellen Sie ein Scatter-Gating-System für die CIK-Zellpopulationen (Abbildung 1A).
   1. Wählen Sie Röhre 1 (leer) und klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um ein FSC-A/SSC-A-Diagramm zu erstellen. Zeichnen Sie ein rechteckiges Gate über die gesamte Zellpopulation mit einem FSC-A-Schwellenwert >5 x 10⁴, um Zellablagerungen auszuschließen.
   2. Wählen Sie den Parameter SSC-A/SSC-H für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Polygon-Gate um alle einzelnen Zellen. Wählen Sie die Parameter Anzahl/FITC (CD3) bzw. Anzahl/APC (CD56) für das neue Histogrammdiagramm aus. Wählen Sie den Parameter FITC (CD3)/APC (CD56) für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Vier-Quadranten-Tor, um die vier Teilpopulationen zu definieren.
   3. Notieren Sie die Daten von 20.000 einzelnen Zellen in jeder Probe. Klicken Sie auf die Schaltfläche Stichprobe laden, um zuerst das leere Steuerelement zu analysieren. Identifizieren Sie die gesamte CIK-Zellpopulation mithilfe der Kanalparameter CD56 und CD3.
4. Schritt 5.3 für die Untersuchung aller Proben wiederholen.
5. Öffnen Sie die Dateien mit den statistischen Werten der einzelnen Probe, um CIK-Zellpopulationen zu analysieren, und drucken Sie sie in Analysedateien nach.

>6. Kultivierung und Färbung von menschlichen chronischen myeloischen Leukämie-K562-Zellen und OC-3-Zellen des Eierstockkarzinoms

1. K562-Zellen
   1. Kultivieren Sie K562-Zellen in einem vollständigen Medium (RPMI-Basalmedium mit 10 % fötalem Rinderserum [FBS] und 50 U/ml-Antibiotika und stellen Sie die Glukose auf 4,5 g/l ein) bei einer Dichte von 0,5-1 x 106 Zellen/ml in einem Zellkulturkolben und inkubieren Sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂.
   2. Das Kulturmedium mit den K562-Zellen wird in sterile 50-ml-Röhrchen überführt und die Zellen am Tag des Experiments 10 Minuten lang bei 18-20 °C bei 300 x g pelletiert.
   3. Den Überstand aspirieren, die Zellen in 5 ml sterilem PBS resuspendieren und gut vorsichtig mischen.
   4. Pelletieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min. Aspirieren Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in PBS und stellen Sie die K562-Zellen auf eine Konzentration von 0,5-1 x 10⁶ Zellen/ml ein.
   5. Geben Sie 0,5 μl Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE)-Farbstoff zu dem 1 ml K562-Zellsuspension in einem sterilen 15-ml-Röhrchen bei einer Endkonzentration von 5 μM. Mischen Sie die Suspension vorsichtig, indem Sie mindestens 3x auf und ab pipettieren.
   6. Lassen Sie das Röhrchen 10–15 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO₂ in einem Zellkultur-Inkubator.
   7. Geben Sie 9 mL PBS in das Röhrchen und pelletieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min. Dekantieren Sie den Überstand und suspendieren Sie dann das Zellpellet in 10 mL vollständigem Medium. Übertragen Sie die Zellsuspension in einen Zellkulturkolben und legen Sie sie in den Inkubator.
2. OC-3-Zellen
   1. Kultur von OC-3-Zellen in einem vollständigen Medium (DMEM/F12-Medium mit 10 % FBS- und 50 U/ml-Antibiotika) bei einer Dichte von 0,5–1 x 10⁶ Zellen in einem Zellkulturkolben bei 37 °C und 5 % CO₂.
   2. Aspirieren Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen 1 Tag vor dem Experiment mit PBS.
   3. Die Zellen werden durch Zugabe von 1 ml Zelldissoziationsenzymlösung (Materialtabelle) abgelöst und 5 Minuten bei 37 °C inkubiert.
   4. Suspendieren Sie die Zellen, indem Sie 5 ml PBS hinzufügen und gut vorsichtig mischen. Pelletieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min und saugen Sie den Überstand an. Resuspendieren Sie die Zellen in PBS und stellen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 0,5–1 x 10⁶ Zellen/ml ein.
   5. Geben Sie 0,5 μl CFSE-Farbstoff zu 1 ml der OC-3-Zellsuspension in einem sterilen 15-ml-Röhrchen bei einer Endkonzentration von 5 μM. Mischen Sie die Suspension vorsichtig, indem Sie mindestens 3x auf und ab pipettieren.
   6. Lassen Sie das Röhrchen 10–15 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO₂ in einem Zellkultur-Inkubator.
   7. Geben Sie 9 mL PBS in das Röhrchen und pelletieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min. Dekantieren Sie den Überstand und suspendieren Sie dann das Zellpellet mit vollständigem Medium. 5 x 10⁵ Zellen/Well in eine 6-Well-Platte aussäen und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ über Nacht inkubieren.

>7. Zytotoxischer Assay

1. Kokultur von CIK- und K562-Zellen (CIK-K562)
   1. Zählen Sie die K562-Zellen aus Schritt 6.1.7 und testen Sie die Zellviabilität mit einem Trypanblau-Ausschlussassay. Geben Sie 1 ml K562-Zellen in jede Vertiefung in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 5 x 10⁵/ml.
   2. 1 ml Basalmedium mit oder ohne CIK-Zellen aus Schritt 3.4 wird wie folgt auf die 6-Well-Platte aus Schritt 7.1.1 gegeben: Vertiefung 1 = Leer, nur K562-Zellen (5 x 10⁵); Vertiefung 2 = nur CFSE-gefärbte K562-Zellen (5 x 10⁵); Vertiefung 3 = CIK-Zellen (E [Effektor], 25 x 10⁵) + CFSE-gefärbte K562-Zellen (T [Ziel], 5 x 10⁵); Vertiefung 4 = CIK-Zellen (E, 50 x 10⁵) + CFSE-gefärbte K562-Zellen (T, 5 x 10⁵).
   3. Mischen Sie die Zellsuspensionen, indem Sie sie mindestens 3x vorsichtig auf und ab pipettieren. Stellen Sie die Platte für 24 Stunden in den Inkubator.
2. Kokultur von CIK- und OC-3-Zellen (CIK-OC-3)
   1. 1 ml Basalmedium mit oder ohne CIK-Zellen aus Schritt 3.4 wird wie folgt auf die 6-Well-Platte aus Schritt 6.2.7 gegeben: Vertiefung 1 = Leer, OC-3-Zellen allein (5 x 105); Vertiefung 2 = nur CFSE-gefärbte OC-3-Zellen (5 x 10⁵); Vertiefung 3 = CIK-Zellen (E, 25 x 10⁵) + CFSE-gefärbte OC-3-Zellen (T, 5 x 10⁵); Vertiefung 4 = CIK-Zellen (E, 50 x 10⁵) + CFSE-gefärbte OC-3-Zellen (T, 5 x 10⁵).
   2. Mischen Sie die Zellsuspensionen, indem Sie sie mindestens 3x vorsichtig auf und ab pipettieren. Legen Sie die Platte für 24 h in den Inkubator.
3. 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) Farbstofffärbung
   1. Ernten Sie die CIK-K562-Zellsuspension aus Schritt 7.1.3 direkt in ein steriles 15-ml-Röhrchen.
   2. Ernten Sie sowohl die Suspensionszellen als auch die adhärenten Zellen aus den CIK-OC-3-Gruppen aus Schritt 7.2.2.
      1. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles 15-ml-Röhrchen. Waschen Sie die Vertiefung mit 1 ml sterilem PBS, sammeln Sie das PBS und geben Sie es in das Röhrchen. Fügen Sie 0,5 ml Zelldissoziationsenzymlösung hinzu und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei 37 °C.
      2. Geben Sie 1 ml der Lösung aus demselben Röhrchen in die entsprechende Vertiefung und mischen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie sie mindestens 3x mit einer sterilen 1-ml-Pipette auf und ab pipettieren. Sammeln Sie alle Zellen in derselben Röhre.
   3. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 300 x g, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml sterilem PBS. Pelletieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 300 x g, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl sterilem PBS.
   4. Geben Sie 5 μl 7-AAD-Farbstoff (50 ng/μl Stamm) in die Zellsuspension. Mischen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie sie mindestens 3x mit einer sterilen 1-ml-Pipette auf und ab pipettieren. 10 Minuten inkubieren und vor der Analyse im Dunkeln stehen lassen.
4. Zytolytischer Fähigkeitsassay
   1. Mischen Sie die Zellsuspension aus Schritt 7.3.4 und wiederholen Sie die Schritte 5.1 und 5.2 einmal.
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Probe, um dem Experiment eine Probe und ein Röhrchen hinzuzufügen, und benennen Sie die Röhrchen wie folgt: Nur Zellen für Röhrchen 1, K562 (oder OC-3); Röhrchen 2, nur CFSE-gefärbte K562- (oder OC-3-) Zellen; Röhre 3, E:T = 5:1; Röhre 4, E:T = 10:1.
   3. Erstellen Sie ein Scatter Gating System für den zytolytischen Assay (Abbildung 2A).
      1. Wählen Sie Röhre 1 aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um ein FSC-A/SSC-A-Diagramm zu erstellen. Zeichnen Sie ein rechteckiges Gate über alle Ereignisse mit einem FSC-A-Schwellenwert >5 x 10⁴, um Zellablagerungen auszuschließen.
      2. Wählen Sie den Parameter SSC-A/CFSE für das neue Punktdiagramm aus. Wählen Sie den Parameter 7-AAD/CFSE für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Vier-Quadranten-Tor, um die vier Teilpopulationen zu definieren.
      3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Sample laden, um zuerst das leere Steuerelement zu analysieren.
      4. Stellen Sie die Spannung von SSC-A und FSC-A ein. Identifizieren Sie die tote Zellpopulation unter Verwendung der Parameter CFSE und 7-AAD-Kanal. Zeichnen Sie die Daten von >20.000 CFSE+-Zellen in jeder Probe auf.
   4. Abschnitt 7.4.6 für die Untersuchung aller Proben wiederholen.
   5. Öffnen Sie die Dateien mit den statistischen Werten jeder einzelnen Probe, um die nicht lebensfähigen Zellpopulationen zu analysieren und die Daten in Analysedateien zu exportieren.

Ergebnisse

Abbildung 1: Der Anteil der CD3⁺CD56⁺ T-Zellen aus einer repräsentativen PBMC-Probe. (A) Lymphozyten wurden anhand der spezifischen Größe und Granularität erkannt. Ausgewählte Einzelzellpopulation für die Analyse mittels Durchflusszytometrie. (B) Die statistische Analyse der Wirksamkeit der CIK-Expansion von drei gesunden Spendern wurde mit einem t-Test durchg...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
7-Amino-Actinomycin D	Bd	559925
APC Mouse Anti-Human CD56 Antikörper	Bd	555518	Nr. B159
APC Maus IgG1, κ Isotyp-Steuerung	Bd	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Durchflusszytometer	Bd	338962		SN: R33896202856
Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFSE)	Bd	565082		Rekonstitution von CFSE-Farbstoff (500 mg) mit 90 mL DMSO
D-(+)-Glukose-Lösung	Sigma	Nr. G8644		Für K562-Zellkulturen. Fügen Sie 12,5 mL bis 500 mL des vollständigen Mediums hinzu
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	HyClone	SH30023.02		Basalmedium für OC-3-Zellkultur
Fötales Rinderserum	HyClone	SH30084.03		Für K562- und OC-3-Zellkulturen. Vollständiges Medium enthält 10 % FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	Artikel-Nr.: 71101700-EK		Lösung des Dichtegradienten
FITC Maus Anti-Human-CD3-Antikörper	Bd	555332	UCHT1
FITC Maus IgG1, κ Isotyp-Steuerung	Bd	555748	MOPC-21
Humane Anti-CD3 mAb	Takara	T210	OKT3	2,5 ml Stamm (1 mg/1 ml) zu 50 ml Induktionsmedium hinzufügen. Lagerbestand bei -80 °C
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122		Fügen Sie 5 mL Stamm (10.000 U/ml) zu 500 mL des vollständigen Mediums hinzu. Lagerbestand bei 4 °C.
Proleukin	NOVARTIS			Rekonstitution von Proleukin-Pulver (22x106 IE) mit 1,2 mL sterilem Wasser und Zugabe von 2,7 mL zu 50 mL Induktionsmedium. Lagerbestand bei -20 °C
Rekombinantes humanes Interferon-gamma	CellGenix	Tel.: 1425-050		Rekonstitution von rh IFN-g (5x105 IE/50 μg) mit 200 μl sterilem Wasser und Zugabe von 20 mL zu 50 mL Induktionsmedium. Lagerbestand bei -20 °C
Rekombinantes humanes Interleukin-1 alpha	PEPROTECH	200-01A		Rekonstituieren Sie rh IL-1α (10 μg) mit 1 mL sterilem Wasser und fügen Sie 5 mL zu 50 mL Induktionsmedium hinzu. Lagerbestand bei -20 °C
RPMI1640 mittel	Gibco	Artikel-Nr.: 11875-085		Basalmedium für die K562-Zellkultur. Lagerbestand bei 4 °C
Sigma 3-18K Zentrifuge	Sigma	Artikel-Nr.: 10295
TrypLE Express Enzym	Gibco	12605028		Enzym zur Zelldissoziation; Zur Entbindung von adhärenten Zellen. Lagerung bei Raumtemperatur
X-VIVO 15 mittel	Lonza	04-418Q		Basalmedium für PBMC- und CIK-Zellen. Lagerung bei 4 °C