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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Vorbereitung des Reagenzes
- Bereiten Sie die Stammlösung des Nährmediums für die Entnahme des gesamten Gewebes vor: 1 l modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco, 110 ml fötales Rinderserum (FBS), 11 ml Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 1 %) und 1,1 ml filtersterilisiertes Insulin (Endkonzentration 0,1 %). Stammlösung bei 4 °C lagern.
- Chelat-Puffer #1 vorbereiten: 30 ml Nährmedien (wie in 1.1 beschrieben), 600 μl 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (Endkonzentration 10 mM), 300 μl Gentamicin (Endkonzentration 1 %) und 60 μl Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %). Stammlösung bei 4 °C lagern.
- Chelat-Puffer #2 vorbereiten: 30 ml Nährmedien (wie in 1.1 beschrieben), 300 μl 0,5 M EDTA (Endkonzentration 5 mM), 300 μl Gentamicin (Endkonzentration 1 %) und 60 μl Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %). Stammlösung bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie humane Minidarm-Medien vor: 41,4 ml DMEM/F-12, 5 ml FBS (endgültige 10%), 500 μl Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 1%), 500 μl L-Glutamin (Endkonzentration 1%), 500 μl Gentamicin (Endkonzentration 1%), 100 μl Amphotericin B (Endkonzentration 0,2%), 500 μl 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure (HEPES) (Endkonzentration 10 mM), 500 μl 100x N-2-Supplement und 1 mL 50x B-27-Supplement minus Vitamin A für ein Gesamtvolumen von 50 mL. Lagerlösung bei -20 °C lagern.
- Vollständige Vorbereitung des humanen Minidarm-Mediums: 10 ml humanes Minidarm-Medium (hergestellt in Nummer 1.4), 10 μl 100 μg/ml Wnt3a (Endkonzentration 100 ng/ml), 10 μl 100 μg/ml Noggin (Endkonzentration 100 ng/ml), 10 μl 1 mg/ml R-Spondin (Endkonzentration 1 μg/ml), 10 μl 500 μg/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) (Endkonzentration 50 ng/ml), 10 μl 1 M N-Acetylcystein (Endkonzentration 1 mM), 10 μl 10 mM Y-27632 (Endkonzentration 10 μM), 10 μl 500 μM A-83 (Endkonzentration 500 nM), 10 μl 10 mM SB202190 (Endkonzentration 10 μM), 100 μl 1 M Nicotinamid (Endkonzentration 10 mM) und 1 μl 100 μM [leu] 15-Gastrin 1 (Endkonzentration 10 nM). Gesamtvolumen 10 mL. Lagerlösung bei 4 °C.
Anmerkung: Die Lösungen müssen innerhalb von 48 Stunden verwendet werden.
>2. Kryptenisolierung und -beschichtung aus ganzem Gewebe
- Zum Zeitpunkt der Entnahme im Operationssaal ist die Dünndarmgewebeprobe des Menschen in kalte Dulbecco-Phosphatpuffersalzlösung (DPBS) zu legen. Waschen Sie die Probe in kaltem DPBS, bis sie frei von Stuhl und Blut ist. Die Probe wird bei 4 °C in RPMI 1640 Medium gelagert, bis sie für die Kryptenisolierung bereit ist.
Anmerkung: Gewebe darf nicht länger als 24 Stunden gelagert werden.
- Stellen Sie sicher, dass die Probe frei von Stuhl und Blut ist. Entfernen Sie mit einer feinen Präparierschere überschüssiges Fett oder chirurgische Klammern/Klammern usw. Wiegen Sie die Probe.
HINWEIS: Streben Sie ein Stück von ca. 0,75-2,5 g an.
- Schneiden Sie die Probe in 0,5 cm große Stücke und geben Sie sie in 30 ml Chelatpuffer #1 (wie in Schritt 1.2 vorbereitet).
- Bei niedriger Geschwindigkeit 15 min bei 4 °C schütteln.
- Filtrieren Sie das Gewebe durch ein 100-μm-Zellsieb und entsorgen Sie den Durchfluss.
- Geben Sie das Gewebe in 30 ml Chelatpuffer #2 (wie in Schritt 1.3 vorbereitet).
- Bei niedriger Geschwindigkeit 15 min bei 4 °C schütteln.
- Filtrieren Sie das Gewebe durch ein 100-μm-Zellsieb und entsorgen Sie den Durchfluss.
- Tauen Sie 500 mL der Basalmembranmatrix auf Eis auf, um sie in Schritt 2.8 zu verwenden.
- Geben Sie 10 mL kaltes DMEM in ein konisches 50-ml-Röhrchen und schütteln Sie es 10 s lang kräftig mit der Hand.
- Durch ein 100 μm Zellsieb filtrieren und den Durchfluss auffangen (Etikett #1). Halte Tube #1 auf Eis.
- Geben Sie das Gewebe zu weiteren 10 mL kaltem DMEM in einem separaten konischen 50-ml-Röhrchen und schütteln Sie es 10 Sekunden lang kräftig mit der Hand.
- Filtrieren Sie durch ein 100-μm-Zellsieb und sammeln Sie den Durchfluss (Etikett #2).
- Wiederholen Sie dies zwei weitere Male, bis vier konische Röhrchen mit Durchfluss vorhanden sind (mit den Röhrchen #1-4 beschriftet).
- Filtrieren Sie das Röhrchen #1 durch ein 100 μm Zellsieb und übertragen Sie den Durchfluss in ein konisches 15-ml-Röhrchen (Etikett #1). Wiederhole dies für #2-4.
- Zentrifugieren Sie 15 mL Röhrchen #1-4 bei 200 x g für 15 min bei 4 °C.
- Entfernen Sie in der Laminar-Flow-Haube den Überstand von den Rohren #1-4 und entsorgen Sie ihn. Vermeiden Sie es, die Gewebewolke unmittelbar über dem Pellet zu stören, auch wenn das bedeutet, dass ein Überstand zurückbleibt.
- Durch langsames Pipettieren mischen Sie das Pellet mit dem übrig gebliebenen Überstand in den Röhrchen #1-4.
- Übertragen Sie die Mischung aus den Röhrchen #1-4 in ein einzelnes konisches 2-ml-Röhrchen.
- Das konische Röhrchen bei 200 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Den Überstand entfernen und das Pellet in 500 μl der Basalmembranmatrix wieder suspendieren.
Anmerkung: Halten Sie die Basalmembranmatrix immer auf Eis und arbeiten Sie schnell für die nächsten Schritte. Dieses Produkt polymerisiert bei Raumtemperatur sehr schnell.
- Tragen Sie 50 μl Proben-/Basalmembran-Matrix-Suspension auf die Mitte einer Vertiefung in einer 24-Well-Platte auf. Diese sollte kuppelförmig aussehen.
Anmerkung: Die Verwendung von gekühlten Pipettenspitzen trägt zu einem reibungsloseren Transfer der Suspension bei und minimiert die Polymerisation.
- Wiederholen Sie den Vorgang 9 Mal, um insgesamt 10 Vertiefungen zu füllen.
- Stellen Sie die 24-Well-Platte für 30 Minuten in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2, um die Polymerisation zu ermöglichen.
- Geben Sie 500 μl Human Minigut Media Complete (wie in Schritt 1.5 vorbereitet) in jede Vertiefung. Alle 2 Tage ersetzen.
- Entnehmen Sie Enteroide nach 5-10 Tagen, wenn die Knospe sichtbar ist. Anweisungen zur Entnahme finden Sie in den Schritten 4 und 5.
>3. Induktion von experimentellen NEC
- Geben Sie an Tag 0 10 μl 5 mg/ml Lipopolysaccharid (LPS) zu 500 μl humanem Minidarm Media Complete (wie in Schritt 1.5 vorbereitet) in jede Vertiefung. Alle 2 Tage bis zur Abholung ersetzen.