In-vitro-Adhäsionsassay zum Nachweis der Adhärenz von Krebszellen an extrazellulären Fallen von Neutrophilen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Najmeh, S., et al. Vereinfachte Isolierung und Handhabung von extrazellulären Neutrophilenfallen (NETs). J. Vis. Exp. (2015)

In diesem Video demonstrieren wir einen Assay, der Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Adhäsion von Krebszellen an neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) nachzuweisen. In den Testvertiefungen gibt es einen bemerkenswerten Anstieg der Anzahl fluoreszenzmarkierter Krebszellen, die an NETs haften, während Wells, die mit DNase behandelt wurden, eine verminderte Adhäsion von Krebszellen an NETs aufweisen.

Protokoll

>1. Statischer Adhäsionsassay für NET-Krebszellen

100 μl des zuvor erhaltenen NET-Materials pro Vertiefung werden in eine 96-Well-Platte mit flachem Boden gegeben und die Vertiefungen O/N bei 4 °C im Dunkeln beschichtet
Überprüfen Sie zwischen 12 und 20 Stunden später unter dem Mikroskop die Bildung einer einheitlichen Monoschicht aus zellfreien NETs am Boden der Vertiefungen (Abbildung 1). Saugen Sie an dieser Stelle vorsichtig alles nicht anhaftende Material aus den Vertiefungen ab und achten Sie darauf, die NET-Monoschicht am Boden nicht zu beschädigen.
100 μl 1 % Rinderserumalbumin (BSA)-Blockierungslösung in jede Vertiefung geben und 1 Stunde bei RT einwirken lassen.
A549-Krebszellen werden mit 2 ml 0,25%iger Trypsin-Lösung aus einem T-75-Kolben abgenommen. Nach dem Ablösen werden 10 ml A549-Medium in trypsinisierte Zellen gegeben und 5 Minuten lang bei 450 x g bei 4 °C zentrifugiert. Überstand verwerfen und Zellen im Medium resuspendieren, um eine Konzentration von 2 x 10⁴Krebszellen pro 100 μl Medium zu erhalten.
Anmerkung: A549-Zellen wurden separat gezüchtet. Kurz gesagt, die Zellen wurden in DMEM F12-Medien kultiviert und konserviert, die 10 % FBS und 1 % Penicillin Streptomycin enthielten, und bei 37 °C 5 % CO₂ inkubiert. Sobald eine Zellkonfluenz von 70 - 80 % erreicht war, wurden sie mit 0,25 % Trypsin-EDTA abgelöst und in den oben beschriebenen Medien resuspendiert.
Färben Sie Krebszellen mit CFSE, indem Sie 1 μl CFSE pro ml Medium hinzufügen und 10 Minuten lang bei RT färben lassen. Nach der Färbung 5 Minuten lang bei 450 x g bei 4 °C zentrifugieren, dann den Überstand verwerfen und die Zellen im Anfangsvolumen des Mediums resuspendieren, um eine Konzentration von 2 x10⁴ Krebszellen pro 100 μl Medium zu erhalten.
Nach 1 Stunde NETs-Blockierung aspirieren Sie die Blockierungslösung vorsichtig und fügen Sie 2 x10⁴Krebszellen in Medien, was 100 μl entspricht, pro Vertiefung über die NET-Monoschicht hinzu und lassen Sie sie 90 Minuten lang bei 37 °C 5% CO₂ haften. Aspirieren Sie die Zellen vorsichtig und geben Sie 100 μl PBS in jede Vertiefung, um nicht adhärente Zellen zu waschen.
Fügen Sie in einigen Vertiefungen 1000 U DNAse I pro Vertiefung für 10 Minuten hinzu, bevor Sie sie waschen, um NETs abzubauen. Dies dient als Negativkontrolle. In anderen Vertiefungen werden 10 μl steriles Wasser pro Vertiefung für 10 Minuten hinzugefügt, das als Fahrzeugkontrolle (VC) dient.
HINWEIS: In der Regel werden 3 Wiederholungen pro Bedingung durchgeführt, um die Stichprobengröße zu erhöhen.
Aspirieren und verwerfen Sie alle Lösungen in den Vertiefungen, so dass nur NETs und adhärente Krebszellen am Boden verbleiben. Geben Sie 100 μl 4%ige Formaldehydlösung pro Vertiefung, um adhärente Krebszellen an NETS zu fixieren, und lesen Sie den Assay unter dem Fluoreszenzmikroskop ab (Abbildung 1). Zeichnen Sie die Ergebnisse grafisch und analysieren Sie sie (Abbildung 2).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

figure-results-1
Abbildung 1. NET-Monolayer. Lichtmikroskopische Aufnahmen der 96-Well-Plattenvertiefungen, die mit NETs beschichtet sind, zeigen (A) eine gleichmäßige Monoschicht von NETs im gesamten Well, im Gegensatz zu (B) einer unzureichenden Beschichtung des Wells mit einer unterbrochenen Schicht von NETs. Maßstabsbalken stellen 40 μm dar.