Färbung von bakteriellen Zellen und Vorbereitung für immunologische Studien

Zusammenfassung

Quelle: Yang, J. et al., Automatisierter Hochdurchsatznachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen.J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt die Färbung und Vorbereitung von Bakterienzellen für immunologische Studien mit rotem Fluoreszenzfarbstoff. Die gefärbten Bakterien werden verdünnt und in einem Wachstumsmedium resuspendiert, um die gewünschte Bakterienkonzentration für die Wirtszellinfektion zu erreichen, die die Vielzahl der Infektionen darstellt.

Protokoll

>1. Bakterienwachstum und Färbung

1. Führen Sie alle bakteriellen Arbeiten in einer Biosicherheitswerkbank der Biosicherheitsstufe 2 durch.
2. Impfen Sie alle Bakterienkulturen, einschließlich Pseudomonas aeruginosa (PAO1), Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis usw., aus dem gefrorenen Glycerinbestand und züchten Sie sie in Tryptischer Sojabrühe (TSB, 3 mL) in einem Schüttelinkubator bei 37 °C über Nacht bei 250 U/min.
3. Am nächsten Tag beimpfen Sie eine Subkultur mit einer Verdünnung von 1:100 im Verhältnis 1:100 und züchten Sie sie 3 h lang in TSB (1 mL) bis zur exponentiellen Phase, messen Sie die optische Dichte, OD bei 600 nm (OD₆₀₀), um dies zu bestätigen. Stellen Sie sicher, dass der OD₆₀₀ im Bereich von 0,4-0,6 liegt.
4. Vor der Durchführung des Bakterien-Wirt-Adhärenz-Assays werden serielle Verdünnungen der Bakteriensuspension auf TSB-Agar-Platten aufgebracht, über Nacht bei 37 °C inkubiert und dann die bakterienkoloniebildenden Einheiten, KBE, aus der Anzahl der Kolonien festgelegt. Für P. aeruginosa entspricht ein OD₆₀₀ von 1,0 2 x 10⁸ lebensfähigen Bakterienzellen/ml und für L. monocytogenes ein OD₆₀₀ von 1,0 entspricht 9 x 10⁸ lebensfähigen Bakterienzellen/ml.
5. Ernten Sie die Bakterienkulturen in exponentieller Phase durch Zentrifugation bei 13.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur (RT) und waschen Sie sie dann einmal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS 1 mL). Resuspendieren Sie die Bakterienpellets in 1 mL 1x PBS und bestimmen Sie die Konzentrationen durch Messung von OD₆₀₀ von Bakteriensuspensionen. Zum Beispiel repräsentiert P. aeruginosa mit OD₆₀₀ von 0,5 eine Konzentration von 1 x 10⁸ Bakterienzellen/ml.
6. Färben Sie die Bakteriensuspension mit einem grünen oder einem roten Fluoreszenzfarbstoff bei RT für 30 min mit sanfter Drehung im Dunkeln. Geben Sie dazu 2 μL des 500-fach konzentrierten Stofffärbefarbstoffs in 1 mL Bakteriensuspension, um den Farbstoff 1-fach zu verdünnen. Zum Abwaschen des Färbefarbstoffs zentrifugieren Sie die gefärbten Bakterien bei 13.000 x g für 2 min und resuspendieren das Pellet dreimal in 1 mL 1x PBS.
   Anmerkung: Wenn im Experiment fluoreszenzmarkierte Bakterien (grün fluoreszierendes Protein (GFP-), rot fluoreszierendes Protein (RFP-), mCherry-, etc.) verwendet werden, dann überspringen Sie diesen bakteriellen Färbeschritt. In diesem Protokoll wurden GFP-markierte P. aeruginosa und rot fluoreszierend gefärbte L. monocytogenes verwendet.
7. Sammeln Sie die gefärbten Bakterienzellen oder GFP-markierten Bakterien durch Zentrifugation bei 13.000 x g für 2 Minuten. Resuspendieren Sie es in frischem F-12K-Medium (1 ml) und messen Sie den OD₆₀₀ jeder Kultur. Verdünnen Sie die Kulturen anschließend auf die gewünschten Konzentrationen, basierend auf der Multiplizität der Infektion (MOI) und der Konzentration der Wirtszelle. Das endgültige Volumen, das in diesem Experiment verwendet wird, beträgt 500 μL.
   Anmerkung: Wenn beispielsweise die Wirtszellkonzentration, die mit der Trypanblau-Färbung gezählt wird, 1 x 10⁵ Zellen/ml beträgt, beträgt die gewünschte Konzentration von Bakterienzellen bei einem MOI von 100 1 x 10⁷ Zellen/ml. Die Konzentration von P. aeruginosa bei 0,5 OD₆₀₀ beträgt 1 x 10⁸/ml. Um die gewünschte Konzentration zu erhalten, verdünnen Sie die P. aeruginosa-Kultur 10-fach und fügen Sie 50 μl resuspendierte Kultur zu 450 μl frischem F-12K-Medium hinzu.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10x PBS	VWR	Nr. 45001-130
BactoView Live Rot	Biotium	Nr. 40101	Farbstoff für Bakterien
Zentrifuge	Eppendorf	5810R
E. coli			Labor-Bestand
F-12k mittel	ATCC	302004	A549 Zellkulturmedium
Fötales Rinderserum	Corning	35-016-CV
L. monocytogenes			NIST-Sammlungen
OD600 DiluPhotometer	IMPLEN
P. aeruginosa			Laborbestand von Dr. Lori Burrows
P. aeruginosa ΔpilA			Laborbestand von Dr. Lori Burrows
S. agalactiae			NIST-Sammlungen
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			NIST-Sammlungen
Typische Sojabrühe	Wachstumszellen	MBPE-4040