Nachweis der Bindung von Vitronectin an bakterielle Oberflächen mittels Durchflusszytometrie

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Singh, B. et al., Assays zur Untersuchung der Rolle von Vitronectin bei bakterieller Adhäsion und Serumresistenz.J. Vis. Exp.(2018)

Dieses Video zeigt den Nachweis der Wechselwirkung von Vitronektin mit bakteriellen Oberflächenproteinen. Die durchflusszytometrische Analyse misst das Fluoreszenzsignal von fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die an Vitronektin gebunden sind, und bestätigt damit deren Vorhandensein an der Bakterienoberfläche. Diese Technik bietet Einblicke in Wirt-Pathogen-Interaktionen und potenzielle bakterielle Infektionstherapien.

Protokoll

>1. Analyse von Vitronectin, Vn als bakterieller Oberflächenprotein-Ligand

Nachweis der Vn-Bindung an der Bakterienoberfläche mittels Durchflusszytometrie
Anmerkung: In der Durchflusszytometrie verwendeten wir Seitenstreuung und Vorwärtsstreuung, um positive Ereignisse zu gaten. Zur Untersuchung der Wechselwirkungen mit Vn, Haemophilus influenzae Typ f, Hif wurden klinische Isolate (n=10) zusammen mit E. coli BL21 (DE3) als Negativkontrolle ausgewählt (Abbildung 1A).
1. Kultur Hif klinische Isolate in Gehirn-Herz-Infusionsmedium (BHI), ergänzt mit 10 μg/ml Nicotinamid, Adenindinukleotid (NAD) und Hämin bei 37 °C mit Schütteln bei 200 U/min. Verwenden Sie Luria-Bertani-Medium, um E. coli zu kultivieren. Ernten Sie Hif in der mittleren logarithmischen Phase (optische Dichte, OD₆₀₀= 0,3) und resuspendieren Sie die Bakterien in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, die 1 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) enthält (Blockierungspuffer; PBS-BSA). Die Suspension wird auf 10⁹ koloniebildende Einheiten, KBE/ml, eingestellt.
2. Die Aliquote mit 5 x 10⁶ KBE werden auf 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen (12 x 75 mm²) übertragen und 1 ml Blockierungspuffer zugegeben. Die Suspension wird 5 Minuten lang bei 3.500 × g bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert, um die Bakterien zu pelletieren, und dann vorsichtig abgesaugt, um den Überstand zu entfernen, ohne das Pellet zu stören.
3. Resuspendieren Sie die Bakterienpellets mit 50 μl Blockierungspuffer mit 250 nM Vn und inkubieren Sie die Proben 1 h lang bei RT ohne Schütteln. Nach der Inkubation pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 3.500 x g für 5 min, dann waschen Sie die Pellets dreimal mit PBS und ähnlichen Zentrifugationsschritten.
4. Dem Bakterienpellet werden 50 μl primäre polyklonale Vn-Antikörper (pAbs) gegen den Menschen bei Schafen in einer Verdünnung von 1:100 in PBS-BSA zugesetzt. Inkubieren Sie die Suspension 1 h lang bei RT, waschen Sie die Bakterien dann dreimal mit PBS, um ungebundene Antikörper zu entfernen (wie in Schritt 1.1.3 beschrieben).
5. Als nächstes fügen Sie 50 μl PBS-BSA hinzu, das Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugierte Esel-Anti-Schaf-pAbs enthält (1:100 Verdünnung) und inkubieren Sie 1 h lang im Dunkeln bei RT
6. Bereiten Sie eine Blindkontrolle vor, indem Sie Bakterien nur mit Blockierungspuffer und pAbs ohne Vn inkubieren.
7. Die Bakterien werden dreimal mit 1 ml Blockierungspuffer gewaschen und die Suspension durch Zentrifugation granuliert, wie in Abschnitt 1.1.2 beschrieben. Zum Schluss resuspendieren Sie das Bakterienpellet mit 300 μl PBS und analysieren es mittels Durchflusszytometrie.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

figure-results-1
Abbildung 1: Haemophilus influenzae Serotyp f bindet Vn über oberflächenexprimierte PH.(A) Ergebnisse der Durchflusszytometrie, die die Bindung von Vn an Zellen klinischer Hif-Isolate zeigen. Jedes klinische Isolat (5 x 10,⁶ KBE) wurde mit 250 nM humanem Vn inkubiert. Der gebundene Ligand wurde mit Hilfe von Anti-Vn-pAbs von Schafen und FITC-ko...