Bewertung der Stromazytokin-induzierten intrazellulären Proteinphosphorylierung mittels Phospho-Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Quelle: Coats, J. S., et al. Expression von exogenen Zytokinen in von Patienten stammenden Xenotransplantaten durch Injektion mit einer Zytokin-transduzierten Stromazelllinie. J. Vis. Exp. (123) (2017).

Dieses Video zeigt die Bewertung der Stromazytokin-induzierten intrazellulären Phosphorylierung von Proteinen in Leukämiezellen. Diese intrazellulären phosphorylierten Proteine werden mit der Phospho-Durchflusszytometrie-Technik quantifiziert.

Protokoll

>1. Phospho-Durchflusszytometrie-Assays zur Bewertung der Aktivität des von Stroma produzierten Zytokins

HINWEIS: Bewerten Sie den Überstand aus dem manipulierten Stroma vor dem ersten Experiment, um die relevante Bioaktivität des stromaerzeugten Zytokins für das einzelne Experiment zu überprüfen. Sobald das manipulierte Stroma validiert ist, sind keine weiteren Tests erforderlich, es sei denn, es werden Stroma eingeführt, die mit einem neuen Vektor hergestellt wurden.

1. Kaufen Sie MUTZ5- und/oder MHH-CALL4-Leukämiezelllinien (TSLP-responsive), rekombinante humane Zytokine und Antikörper, die für die Verwendung in Phospho-Durchflusszytometrie-Assays zugelassen sind, um geeignete nachgeschaltete Phosphorylierungsziele zu erkennen.
2. Thaw erntete Überstand aus Kontroll- und Zytokin-exprimierendem Stroma.
3. Die Leukämiezelllinien werden in R20-Medium (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 0,2 x 10⁶ Zellen pro Well in einer 96-Well-Gewebekulturplatte plattiert. Platte 3 Wells pro Zustand, um dreifache Assays zu ermöglichen. 2 h bei 37 °C inkubieren. Diese Zeit ermöglicht den Verlust jeglicher Phosphorylierung, die unter früheren Kulturbedingungen aufgetreten ist.
   HINWEIS: 12 Wells pro Zelllinie liefern dreifache Assays für jede in Schritt 1.4 gezeigte Versuchsbedingung.
4. Nach 2 Stunden in Kultur werden die Zellen aus jeder Vertiefung in separate 4-ml-Röhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 500 x g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert.
   1. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl für jede der folgenden experimentellen Bedingungen (führen Sie Assays in dreifacher Ausfertigung durch): 1) nur negatives Kontrollmedium, 2) positives Kontrollmedium mit rekombinantem Zytokin in gesättigter Konzentration(en) (TSLP bei 15 ng/ml usw.), 3) Kontrollstroma-Überstand aus Kontrollstroma und 4) Zytokin-Stroma-Überstand aus Zytokin-produzierendem Stroma.
5. Inkubieren Sie die Zellen für die Dauer, die durch einen spezifischen kommerziellen Phospho-Assay angegeben wird (z. B. 30 min für Phospho-STAT5 in MUTZ5 oder MHH-CALL4 als Reaktion auf TSLP).
6. Bei 500 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand dekantieren.
7. Führen Sie eine Phospho-Durchflusszytometrie-Färbung gemäß dem Protokoll des Herstellers durch und sammeln Sie Durchflusszytometriedaten.
8. Analysieren Sie Durchflusszytometriedaten.
   1. Gate auf intakten Zellen basierend auf der Vorwärts- (FSC, zeigt die Zellgröße an) und der seitlichen (SSC, zeigt Zellgranularität an) Lichtstreuung.
   2. Bestimmen Sie die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) der intakten Zellen in jeder Probe. Es wird der durchschnittliche MFI, der aus den dreifachen Werten des Stromazellüberstands ermittelt wird, mit dem der Kontrollen mit positiven und negativen Medien verglichen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 mL serologische Pipetten	Falke	357551
Konische 15-ml-Röhrchen aus Polypropylen	Fischer	Tel.: 05-539-12
Konische Röhrchen aus Polypropylen 50 mL	Falke	352098
1 mL Pipettenspitzen	Fischer	2707509
200 μl Pipettenspitzen	Denville Scientific	P3020-CPS
10 μl Pipettenspitzen	Denville Scientific	P-1096-CP
"R20" Zellkulturmedium, % des Gesamtvolumens (ergibt 195 mL)			Labor-Rezept
RPMI, 76,84 % (150 ml)	Medientechnik	10-040-CV
FBS, 20,49 % (40 ml)	Medientechnik	35-011-CV
2 mM L-Glutamin, 1,02 % (2 ml)	Medientechnik	35-011-CV
1 mM Na-Pyruvat, 1,02 % (2 ml)
Penicillin-Streptomycin, 0,51 % (1 ml)	Medientechnik	30-002-Cl
2-Mercaptoethanol, 0,10 % (0,1 M), 0,10 % (200 μL)	mp	190242
Biologics
"CALL-4" MHH-CALL-4-Zelllinie, humane B-Zell-Vorläufer-Leukämie	DSMZ	ACC 337
MUTZ-5-Zelllinie, humane B-Zell-Vorläufer-Leukämie	DSMZ	ACC 490
Rekombinantes humanes TSLP-Protein	F&E-Systeme	Artikel-Nr.: 1398-TS-010
Durchflusszytomere-Antikörper (Klon)*
Anti-Maus CD45 FITC (30F11)	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (alternativer Name ist IL-7Rα)	Miltenyi Biotec	Artikel-Nr.: 130-098-094
CD34 Schützenpanzer (8G12)	BD Biowissenschaften	340667
CD45 PE-Cy7 (HI30)	eBiowissenschaften	Tel.: 25-0459
"FVD" Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 780	eBiowissenschaften	Tel.: 65-0865
Ig κ Lichterkette FITC (G20-193)	BD Pharmingen	555791
Ig λ Leichtmetallkette FITC (JDC-12)	BD Pharmingen	561379
IgD PE (IA6-2)	BioLegende	348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)	BD Biowissenschaften	551079
pSTAT5 PE, Maus Anti-STAT5 (pY694)	BD PhosphoFlow	612567
Sonstige Materialien & Ausrüstung
FlowJo Software für die Durchflusszytometrie-Analyse	FlowJo, LLC	Variante 10
*Alle Antikörper sind, sofern nicht anders angegeben, gegen den Menschen.