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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Gewebevorbereitung für die Fixierung und Paraffineinbettung
HINWEIS: Biopsien wurden von einwilligenden Frauen entnommen, die sich einer Zystoskopie mit Elektrofulguration der Trigonitis zur fortgeschrittenen Behandlung von rezidivierenden Harnwegsinfektionen (rUTI) unterziehen. rUTI ist definiert als 3 Harnwegsinfektionen in 12 Monaten. Die Biopsieentnahme wurde im Operationssaal durchgeführt, während der Patient unter Narkose stand, nachdem die Einwilligung des Patienten eingeholt worden war. Alle Proben wurden vor dem Experimentieren kodiert und de-identifiziert.
- Entnehmen Sie eine Cold-Cup-Biopsie (~1 mm3) aus dem Blasentrigon mit einer urologischen Pinzette über ein flexibles Zystoskop und legen Sie es sofort in ein steriles 2-ml-Kryofläschchen mit 1,5 ml 4 % v/v-Paraformaldehyd (PFA), das in 1x steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt wurde.
HINWEIS: 4% PFA in 1x PBS können im Voraus hergestellt und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert werden.
- Fixierte Biopsie für 6 h bei Raumtemperatur oder für 16-24 h bei 4 °C.
HINWEIS: Die Fixierungsdauer sollte auf der Grundlage der Größe der Gewebeprobe berechnet werden, und eine Überfixierung sollte vermieden werden. Es wird nicht empfohlen, Glutaraldehyd als Fixiermittel zu verwenden, da es eine Autofluoreszenz einführt.
- Entfernen Sie das Fixiermittel in einer sterilisierten Haube oder Biosicherheitswerkbank durch Pipettieren und ersetzen Sie es durch 1,5 ml sterile 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). Halten Sie die Proben über Nacht bei 4 °C oder führen Sie sofort eine Gewebeaufbereitung und Paraffineinbettung durch.
- Verwenden Sie ein sterilisiertes Mikrotom, um Gewebeblöcke mit einer Dicke von 5 μm zu schneiden, und kleben Sie Paraffingewebeschnitte auf geladene Glasobjektträger. Für das 16S ribosomale RNA (16S rRNA) Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsprotokoll (FISH) sind mindestens zwei Objektträger pro Biopsie erforderlich.
HINWEIS: Das Biopsiegewebe sollte im Querschnitt relativ zur Schnittebene angeordnet sein, um eine Visualisierung der Urothelschichten in allen Schnitten zu gewährleisten. Es sollte auch beachtet werden, dass die Schnittdicke für den Nachweis der Bakteriengemeinschaft optimiert werden sollte. Dünnere Schnitte oder die Probenahme mehrerer serieller Schnitte kann bei Infektionen erforderlich sein, bei denen geweberesidente Bakterien extrem selten sind (z. B. <1 geweberesidentes Bakterium pro 1.000 Säugetierzellen).
>2. Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit universellen 16S rRNA-Sonden
HINWEIS: Pro Biopsie sind zwei Objektträger erforderlich. Ein Objektträger wird für die universelle 16S rRNA-Sonde und ein Objektträger für eine Kontrollsonde mit einer verschlüsselten Sequenz benötigt. Dies ist wichtig, um das wahre Signal während der Mikroskopie vom Hintergrundsignal zu unterscheiden, da das Blasenepithel in mehreren Kanälen autofluoreszierend ist. Zusätzlich zur Scramble-Sonde kann die Blockierung mit 0,1 % Sudan Black B vor der Montage die dem Gewebe inhärente Hintergrund-Autofluoreszenz reduzieren.
- Vorbereitung der Reagenzien und des Abzugs
- Reinigen Sie einen leeren Abzug (oder eine entsprechend ausgestattete Biosicherheitswerkbank) mit 70 % Ethanol.
- Bereiten Sie den Hybridisierungspuffer bestehend aus 0,9 M Natriumchlorid (NaCl), 20 mM Tris (Hydroxymethyl)-Aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl, pH 7,2) und 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) in 10 mL sterilfiltriertem Wasser vor.
HINWEIS: Sterilfiltriertes Wasser kann hergestellt werden, indem autoklaviertes destilliertes Wasser durch einen 0,22-μM-Filter geleitet wird. Der Hybridisierungspuffer kann bei Raumtemperatur gelagert werden, aber das SDS kann aus der Lösung ausfallen. Wenn SDS ausfällt, erwärmen Sie die Lösung vor der Verwendung in einem 50 °C warmen Wasserbad.
- Bereiten Sie jeweils mindestens 100 ml 95 % und 90 % Ethanol in steril gefiltertem Wasser in gewaschenen, autoklavierten Flaschen vor.
- Fluoreszenzmarkierte lyophilisierte Sonden werden in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Puffer (TE), hergestellt in filtersterilisiertem, nukleasefreiem Wasser, auf eine Endkonzentration von 100 μM gelöst. Eine Verdünnung von 1 μM in TE-Puffer für die Verwendung in diesem Protokoll wird vorbereitet. Lagern Sie sowohl 100 μM konzentrierte als auch 1 μM konstituierte Laborsonden bei -20 °C lichtgeschützt.
HINWEIS: Fluoreszenzmarkierte Sonden nicht in Wasser auflösen. Eine Pufferung ist erforderlich, um die Hydrolyse der N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Esterbindung zu verhindern, die das Fluorophor an die Nukleotidsonde konjugiert.
- Fünf Coplin-Gläser mit 70 % Ethanol (EtOH) reinigen, trocknen lassen, wie folgt beschriften: Xylole I, Xylole II, 95 % EtOH, 90 % EtOH, doppelt destilliertes Wasser (ddH2O) und mit 100 mL der entsprechenden Lösung auffüllen. Dies hilft, Verwirrung in späteren Schritten zu vermeiden.
- Entparaffinisierung und Rehydrierung des Gewebes
- Legen Sie in der Haube zwei Objektträger pro Biopsie in ein vertikales Objektträgergestell.
- Stellen Sie einen vertikalen Schieber für 10 Minuten in das Xylol-I-Coplin-Glas (mit 100 ml Xylolen).
- Entfernen Sie das Schiebegestell von Xyloles I und tupfen Sie den Boden auf ein Papiertuch, um überschüssige Xylole zu entfernen. In das Xylol-II-Coplin-Glas für 10 Min. geben
HINWEIS: Arbeiten Sie niemals mit Xylolen außerhalb eines zertifizierten Abzugs.
- Rehydrieren Sie deparaffinisierte Gewebeschnitte in aufeinanderfolgenden Ethanol-Waschgängen (95 % und 90 %) für jeweils 10 Minuten in den jeweils beschrifteten Coplin-Gläsern.
HINWEIS: Während dieser Phase erwärmen Sie den Hybridisierungspuffer in einem Wasserbad auf 50-56 °C.
- Nehmen Sie den Schieber aus der 90%igen Ethanolwäsche, tupfen Sie den Boden auf Küchenpapier ab, um überschüssiges Ethanol zu entfernen, und stellen Sie ihn für 10 Minuten in das ddH2O Coplin-Glas mit 100 ml filtersterilisiertem ddH2O.
- Während Sie auf die ddH2O-Reinigung warten, verdünnen Sie die Sonden auf 10 nM in einem Hybridisierungspuffer, um die Färbelösung herzustellen. Bereiten Sie 150 μl Färbelösung pro Objektträger vor.
HINWEIS: Schützen Sie die Färbelösung vor Licht, indem Sie die Tuben in Aluminiumfolie einwickeln und in einer Schublade aufbewahren. Wenn Sie mit fluoreszenzmarkierten Sonden auf dem Labortisch arbeiten, sollten Sie die Deckenbeleuchtung nach Möglichkeit ausschalten. Im Hybridisierungspuffer verdünnte Sonden sollten nicht wiederverwendet werden.
- Hybridisierung und Gegenfärbung
- Bereiten Sie für jede Sonde eine Befeuchtungskammer vor, indem Sie eingeweichtes, zerknittertes Kimwipe und steriles Wasser in den Behälter einer P1000-Spitzenbox geben. Setzen Sie die Spitzenhalterpatrone darauf - hier werden die Schlitten sitzen.
HINWEIS: Es ist wichtig, eine Befeuchtungskammer zu verwenden, um ein Austrocknen der Biopsieabschnitte während der Hybridisierung zu verhindern. Zu beachten ist, dass handelsübliche Befeuchterkammern so ausgelegt sind, dass sie eine stabile, feuchte Atmosphäre aufrechterhalten. Die hier beschriebene Technik kontrolliert jedoch die Luftfeuchtigkeit ausreichend und zu wesentlich geringeren Kosten.
- Nehmen Sie die Objektträger aus dem Objektträgerhalter und legen Sie sie auf ein frisches Papiertuch (mit dem Taschentuch nach oben). Verwenden Sie ein Kimwipe, um den Objektträger zu trocknen. Achten Sie darauf, nur vorsichtig in der Nähe (nicht auf) den Biopsieabschnitt zu tupfen, um Wasser abzuleiten. Ziehen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Rand um den Biopsieschnitt und legen Sie den Objektträger mit der Seite nach oben in die Befeuchtungskammer.
HINWEIS: Arbeiten Sie schnell, damit das Gewebe vor der Hybridisierung nicht austrocknet.
- Stellen Sie die Befeuchtungskammer in einen auf 50 °C eingestellten Inkubator. Pipettieren Sie 50-150 μl der Färbelösung direkt auf das Gewebe, so dass das Rechteck, das durch den hydrophoben Rand um das Gewebe gebildet wird, gefüllt ist. Achten Sie darauf, nicht zu viel Lösung hinzuzufügen, um den hydrophoben Rand zu überlaufen. Verschließen Sie die Box vorsichtig.
- Über Nacht (~16 h) bei 50 °C im Dunkeln inkubieren. Wenn der Inkubator ein Fenster hat, decken Sie es mit Alufolie ab, um eine dunkle Umgebung zu schaffen.
HINWEIS: Für ein zuverlässiges Signal ist eine Hybridisierungstemperatur unterhalb der Schmelztemperatur der FISH-Sonde erforderlich. 50 °C ist die optimale Temperatur für die universelle 16S rRNA-Sonde, aber möglicherweise nicht optimal für andere Sonden.
- Bereiten Sie am nächsten Morgen mindestens 500 ml Waschpuffer bestehend aus 0,9 M Natriumchlorid (NaCl) und 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) in ddH2O vor und sterilisieren Sie es in eine sterile Flasche mit einem Vakuumfilter mit Flaschenaufsatz. Im Wasserbad auf 50-56 °C erwärmen.
- Nehmen Sie die Objektträger aus den Befeuchtungskammern und saugen Sie die verbleibende Hybridisierungslösung vorsichtig mit einem Kimwipe ab. Legen Sie die Objektträger in ein vertikales Färbegestell.
- Stellen Sie das Färbegestell für 10 Minuten in ein undurchsichtiges Coplin-Glas mit 100 ml vorgewärmtem Waschpuffer. Wenn die Coplin-Gläser nicht undurchsichtig sind (z. B. Glas), stellen Sie sie während der Inkubationsschritte im Dunkeln auf – vielleicht unter einer Schachtel oder in einer Schublade.
- Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal mit frischem Waschpuffer in neuen Coplin-Gläsern.
- Bereiten Sie während der Waschschritte den Gegenfleck vor, indem Sie eine 100 μg/ml-Stammlösung von Hoechst 33342 1:1.000 im Waschpuffer verdünnen. Geben Sie in dasselbe Röhrchen Alexa-555 Weizenkeimaggglutinin (WGA) bis zu einer Endkonzentration von 5 μg/ml und Alexa-555 Phalloidin bis zu einer Endkonzentration von 33 nM. Bis zur Gebrauchsgebrauch im Dunkeln lagern.
HINWEIS: Hoechst, Alexa-555 WGA und Alexa-555 Phalloidin markieren Desoxyribonukleinsäure (DNA), Mucin/Uroplakine bzw. Aktin und können gemäß den Anweisungen des Herstellers langfristig im Dunkeln gelagert werden. Fluoreszierende Markierungen, die für Sonden und Gegenfärbungen verwendet werden, können für die für das zu verwendende Mikroskop verfügbaren Filtersets angepasst werden.
- Entfernen Sie die Objektträger der letzten Wäsche und leiten Sie überschüssigen Waschpuffer vorsichtig mit einem Kimwipe ab. Legen Sie die Objektträger mit der Taschentuchseite nach oben auf ein Papiertuch und geben Sie 50-150 μl Gegenfärbung direkt auf das Taschentuch, so dass der hydrophobe Rand gefüllt, aber nicht überläuft. Decken Sie bis zu vier Objektträger mit einer Kryobox ab und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Legen Sie die Seiten wieder in das Färbegestell und waschen Sie sie noch zweimal in Coplin-Gläsern mit frischem Waschpuffer für jeweils 10 Minuten.
- Trocknen Sie die Objektträger nach der letzten Wäsche gründlich ab und legen Sie sie mit dem Taschentuch nach oben auf ein Papiertuch unter eine Kryobox. Drücken Sie einen Tropfen Eindeckmittel direkt auf das Gewebe. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas in der richtigen Größe (hängt von der Größe der Biopsie ab) darauf. Drücken Sie alle Blasen vorsichtig heraus, da sie die Bildgebung beeinträchtigen und die Objektträger über Nacht im Dunkeln aushärten können.
- Versiegeln Sie am nächsten Tag die Ränder des Deckglases zum Objektträger mit einer leichten Schicht Klarlack. 10 min im Dunkeln trocknen lassen und dann im Dunkeln bei 4 °C für die konfokale Mikroskopie lagern.
>3. Visualisierung von 16S rRNA FISH durch konfokale Mikroskopie
HINWEIS: Für dieses Protokoll werden die besten Ergebnisse mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit 63x und 100x Objektiven erzielt. Geeignete Filtersets für die Visualisierung der Hoechst-, Alexa-488- und Alexa-555-Fluoreszenz sind erforderlich. Die Standard-Fluoreszenzmikroskopie kann jedoch verwendet werden, wenn kein konfokales Mikroskop zur Verfügung steht. Dieses Protokoll gilt für ein konfokales Laserscanning-Mikroskop.
- Schalten Sie das konfokale Mikroskop und die mit dem Mikroskop verbundene Computersoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.
- Laden Sie die Folie und visualisieren Sie mit dem 10-fach-Objektiv im blauen (Hoechst) Kanal. Fokussieren Sie vorsichtig, bis die Kerne sichtbar sind.
- Stellen Sie nach dem Fokussieren das Objektiv auf eine hohe Vergrößerung (63x oder 100x) um. Öl auf das Deckglas geben. Fokussieren Sie mit dem neuen Objektiv neu und stellen Sie sicher, dass die Objektivlinse beim Fokussieren mit Öl in Berührung kommt.
HINWEIS: Verwenden Sie nur eine Feinfokussierung bei hoher Vergrößerung (63x oder 100x). Öl sollte nur für ein Ölziel verwendet werden.
- Beurteilen Sie schnell jeden Objektträger durch das Okular im grünen Kanal (enhanced green fluorescent protein, eGFP/Alexa-488), um festzustellen, welche Objektträger FISH-positiv und welche FISH-negativ sind.
HINWEIS: Es ist am besten, wenn diese erste Bewertung/Bewertung verblindet von einer separaten Person durchgeführt wird, um experimentelle Verzerrungen zu reduzieren.
- Um die gefärbten Biopsien abzubilden, beginnen Sie mit einem FISH-Positivobjektträger und wechseln Sie in den Computervisualisierungsmodus. Wählen Sie die Kanäle 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488) und 555 (Alexa-555) aus. Stellen Sie die Lochblende mit dem Kanal mit der längsten Wellenlänge ein, in diesem Fall 555. Finden Sie die richtige Fokusebene für die Visualisierung markierter Bakterien im 488-Kanal. Stellen Sie die Verstärkung, die Laserleistung und den Offset für jeden Kanal so ein, dass das Signal nicht gesättigt und der Hintergrund nicht überkorrigiert wird, ohne die Fokusebene zu ändern. Erfassen Sie das Bild in allen drei Kanälen.
HINWEIS: Verwenden Sie die gleichen Einstellungen für den Kanal 488, um jeden Objektträger in einem Experiment abzubilden. Die Laserleistung muss möglicherweise in den Kanälen 405 und 555 angepasst werden, wenn sich die optimale Fokusebene für die bakterielle Visualisierung zwischen den Feldern ändert.