Eine in vitro Technik zur UV-Bestrahlungs-vermittelten Erzeugung apoptotischer T-Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Hodge, M. X., et al. In-vivo-Bewertung der Alveolarmakrophagen-Efferozytose nach Ozonexposition. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Induktion von Apoptose in den Jurkat-Zellen — einer humanen T-Lymphozyten-Leukämie-Zelllinie. Die Zellen werden ultravioletter C (UVC)-Strahlung ausgesetzt, die umfangreiche DNA-Schäden verursacht und zum apoptotischen Zelltod führt.

Protokoll

>1. Vorbereitung der Jurkat T-Zelllinie (Tag 2)

HINWEIS: Alle Verfahren sollten in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II durchgeführt werden.

1. Kultivieren Sie Jurkat-T-Zellen in 24 ml Basalzellkulturmedium + 10 % FBS + 5 % Penicillin/Streptomycin bei 37 °C + 5 % CO₂ (Materialtabelle). Jurkat-T-Zellen sind eine Suspensionszelllinie, die durch Übergabe von 1:6-1:8 in vorgewärmte Kulturmedien alle 3 Tage aufrechterhalten werden kann. Nicht schütteln.
2. Um apoptotische Zellen herzustellen, züchten Sie sie in jedem Kolben auf 90 % Konfluenz (was nach der Passage 3-4 Tage dauert). Für diese Studie werden Zellen aus fünf T75-Flaschen verwendet, um eine ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten, die in diesem Protokoll verwendet werden.
   Anmerkung: Ein konfluenter Kolben enthält etwa 20-24 Millionen Zellen.
3. Pipettieren Sie Zellen (d. h. den gesamten Kolben) aus jedem Kolben (ca. 24 ml) und übertragen Sie die Zellen mit einer serologischen Pipette in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen. Verwenden Sie mehrere konische Röhrchen für mehrere Kolben.
4. Zählen Sie die Zellen, indem Sie ein 11-μl-Aliquot von Zellen aus dem konischen 50-ml-Röhrchen entfernen und mit 11 μl Trypanblau-Färbung mischen und 11 μl auf Hämozytometer-Objektträger pipettieren.
5. Führen Sie den Objektträger in einen automatisierten Zellzähler ein und notieren Sie die Anzahl der lebenden Zellen, um die Gesamtzellzahl in jedem Kolben zu berechnen, indem Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit 24 multiplizieren, da jeder Kolben 24 ml Medium enthält.
6. Die Zellsuspension bei 271 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren, um Zellen zu pelletieren.
7. Entsorgen Sie den Überstand durch Aspiration und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Medium, um 3,0 x 10⁶ Zellen pro ml zu erhalten.
8. Aliquotieren Sie 5 ml Zellen in 100 mm x 20 mm Gewebekulturschalen (es werden ungefähr neun Schalen verwendet; die Gesamtanzahl der Zellen in jeder Schale sollte ~15 x 10⁶ betragen).
9. Verwenden Sie eine Schale zur Kontrolle/nicht belichtet, und die restlichen Schalen werden der UV-Strahlung ausgesetzt.
10. Stellen Sie den UV-Vernetzer auf das richtige Energieniveau ein, drücken Sie die Energietaste und geben Sie über den Ziffernblock "600" ein, was die Maschine als 600 μJ/cm² x 100,
    anzeigt Anmerkung: Die Energieeinheiten des UV-Vernetzers werden in μJ/cm² x 100 angegeben; Um also 60 Millijoule/cm² zu erreichen, müssen die Einheiten entsprechend dem UV-Vernetzer umgerechnet werden.
11. Alle Schalen werden mit Zellen, ohne die Kontrolle, mit 60 Millijoule (mJ)/^cm2 unter Verwendung des UV-Vernetzers bestrahlt. Entfernen Sie während der UV-Belichtung die obere Abdeckung der Gewebekulturschalen, da UV-Licht die Kunststoffabdeckung nicht durchdringt.
12. Alle Schalen in einem Zellkultur-Inkubator, einschließlich der nicht exponierten Kontrolle, werden 4 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert.
13. Bestätigen Sie die Apoptose durch Durchflusszytometrie mit einem Apoptose-Assay-Nachweiskit, das Annexin V und Propidiumiodid (PI) (Marker für Apoptose bzw. Nekrose) enthält, nach 4 Stunden Inkubation gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    Anmerkung: Die Bestrahlung von Jurkat-T-Zellen im UV-Vernetzer bei einem Energieniveau von 600 μJ/^cm2 nach einer 4-stündigen Inkubation führt zu ≥75% der apoptotischen Zellen (sowohl früh als auch spät) mit einem höheren frühen apoptotischen Phänotyp als mit dem späten apoptotischen Phänotyp. Dies macht es für Alveolarmakrophagen einfacher, sie zu erkennen und zu verschlingen, da ihre Membranen im Gegensatz zu späten apoptotischen Zellen nicht beeinträchtigt sind, was zu einem höheren efferozytären Index und einer genaueren Abbildung der Alveolarmakrophagen-Efferozytose in dieser Studie führt.
    1. Sammeln Sie 333 μl (1 x 10,⁶ Zellen) Jurkat-T-Zellen aus mehreren Schalen (sowohl "ohne UV" als auch "UV-exponiert"), um sie für Kompensationsanalyseröhrchen zu verwenden.
    2. Aliquot 333 μl Jurkat-T-Zellen in einer ungefärbten Annexin-V-Einzelfärbung, PI-Einzelfärbung, ohne UV-Kontrolle und 600 μJ/cm² UV-exponierte markierte Durchflusszytometrie-Röhrchen.
    3. Die Röhrchen bei 188 x g für 5 min bei RT zentrifugieren und den Überstand dekantieren.
    4. Waschen Sie die Zellen durch Resuspendieren in 500 μl kalter, 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    5. Zentrifugieren und Küvetten bei 188 x g für 5 min bei RT zentrifugieren. Den Überstand nach der Zentrifugation verwerfen.
    6. Bereiten Sie 400 μl 1x Bindungspuffer pro Durchflussröhrchen vor, indem Sie 10x Bindungspuffer mit destilliertem Wasser verdünnen, während die Zellen zentrifugieren.
    7. Bereiten Sie das Inkubationsreagenz für Annexin V und PI (100 μl pro Probe/Röhrchen) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
    8. Der Überstand wird nach der Zentrifugation dekantiert und alle Röhrchen vorsichtig in 400 μl 1x Bindungspuffer resuspendiert, dann werden 100 μl Annexin V Inkubationsreagenz in jedes Probenröhrchen gegeben. Geben Sie zuletzt 100 μl Annexin V Einzelfärbung und PI Einzelfärbung in ihre jeweiligen Röhrchen, aber fügen Sie nichts über den 1x Bindungspuffer hinaus in das ungefärbte Röhrchen hinzu.
    9. Inkubieren Sie die Röhrchen 15 Minuten lang im Dunkeln bei RT.
    10. Alle Zellen bei 188 x g für 5 min bei RT zentrifugieren und den Überstand dekantieren.
    11. Resuspendieren Sie die Zellen in 400 μl 1x-Bindungspuffer und analysieren Sie die Proben dann mittels Durchflusszytometrie auf Apoptose. Erfassen Sie mindestens 10.000 Ereignisse pro Röhrchen, um eine genaue Darstellung der Färbung zu ermöglichen.
14. Kombinieren Sie alle bestrahlten Zellen aus Schalen in ein konisches 50-ml-Röhrchen und Pelletzellen durch Zentrifugation bei 271 x g für 5 min bei RT.
15. Der Überstand wird durch Aspiration aus dem Röhrchen verworfen und die Zellen in 24 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Pelletzellen durch Zentrifugation bei 271 x g für 5 min bei Raumtemperatur resuspendiert.
16. Der Überstand wird durch Aspiration aus dem Röhrchen verworfen und die Zellen werden in der Menge an PBS resuspendiert, die für die Dosierung von Mäusen verwendet wird, die von der IACUC zugelassen sind. Die verwendete Dosis liegt zwischen 5-10 x 10⁶ Zellen/50 μl pro Maus; resuspendieren Sie daher bei 10 Mäusen in 500 μl (die Anzahl der Zellen in jeder Dosis variiert je nachdem, wie viele Zellen für die Bestrahlung kultiviert werden).
    Anmerkung: Nehmen Sie mindestens zwei zusätzliche Dosen vor, um Flüssigkeit zu berücksichtigen, die an den Seiten der Pipettenspitze haften bleiben und zum Verlust von Zellen führen kann.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Annexin V-FITC Bausatz	Trevigen	4830-250-K	Das TACS Annexin V-FITC Kit ermöglicht eine schnelle, spezifische und quantitative Identifizierung der Apoptose in einzelnen Zellen bei Verwendung der Durchflusszytometrie.
BCL2 Jurkat T-Zellen	ATCC	ATCC CRL-2899	Die BCL2-Jurkat-Zelllinie wurde durch Transfektion humaner Jurkat-T-Zellen mit dem pSFFV-neo-Säugetier-Expressionsvektor gewonnen, der das humane BCL-2-ORF-Insert und ein Neomycin-resistentes Gen enthält. Wurde für Modelle zur Messung der Efferozytose verwendet.
Gräfin II Automatisierter Zellzähler	Thermofischer	AMQAX1000	Es handelt sich um eine Tisch-Assay-Plattform, die mit modernster Optik, vollständigem Autofokus und Bildanalysesoftware für die schnelle Beurteilung von Zellen in Suspension ausgestattet ist. Sehr einfach zu bedienen.
Cytospin 4 Zytozentrifuge	Thermofischer	A78300003	Bietet wirtschaftliche Dünnschichtpräparationen aus jeder flüssigen Matrix, insbesondere aus hypozellulären Flüssigkeiten wie bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit.
Fötales Rinderserum, qualifiziert, hitzeinaktiviert	Thermofischer	16140071	Versorgt kultivierte Zellen mit Nährstoffen, damit sie wachsen können. Es ist Standard für Zellkulturen.
Penicillin-Streptomycin	Sigma/Aldrich	Nr. P0781-100ML	Penicillin-Streptomycin ist die am häufigsten verwendete Antibiotikalösung für die Kultivierung von Säugetierzellen. Darüber hinaus wird es verwendet, um sterile Bedingungen während der Zellkultur aufrechtzuerhalten.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Ergänzung	Thermofischer	61870036	RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) wurde ursprünglich entwickelt, um menschliche leukämische Zellen in Suspension und als Monoschicht zu kultivieren. Seitdem wurde festgestellt, dass das RPMI 1640-Medium für eine Vielzahl von Säugetierzellen geeignet ist, darunter HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, Astrozyten und Karzinome. Hilft beim schnellen und effizienten Wachstum von Jurkat-T-Zellen.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV-Vernetzer	Cambridge Scientific	Artikel-Nr.: 16659	Der Stratalinker UV-Vernetzer wurde entwickelt, um Apoptose zu induzieren, DNA oder RNA mit Nylon-, Nitrozellulose- oder nylonverstärkten Nitrozellulosemembranen zu vernetzen.