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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Probenvorbereitung
- Sammeln Sie peripheres Blut in heparinisierten 9-ml-Röhrchen und halten Sie die Probe in einem Rotor bei Raumtemperatur (RT), bis sie für das Versuchsprotokoll benötigt wird.
- Beschriften Sie 5-ml-Zytometerröhrchen für Negativkontrollen (2 Röhrchen), Positivkontrollen (2 Röhrchen) und unterschiedliche Konzentrationen von Allergenen/Arzneimitteln (1 Röhrchen pro getesteter Allergen-/Arzneimittelkonzentration). Legen Sie die Röhrchen in ein Gestell, in dem die Röhrchen perfekt passen, ohne zu verrutschen.
- Bereiten Sie den Stimulationspuffer in doppelt destilliertem Wasser mit 2 % (v/v) HEPES, 78 mg/l NaCl, 3,7 mg/l KCl, 7,8 mg/l CaCl2, 3,3 mg/l MgCl2, 1 g/l HSA vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und fügen Sie IL-3 in einer Menge von 2 ng/ml hinzu. In der Regel 100 mL zubereiten und in 2,5 mL Aliquots aufteilen, um bei -20 °C eingefroren zu werden.
- Positivkontrollen in PBS-Tween-20 0,05 % (v/v) (PBS-T): Positivkontrolle 1, N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP) (4 μM), zur Bestätigung der Qualität von Basophilen; Positivkontrolle 2, Anti-IgE (0,05 mg/ml) als IgE-vermittelte Positivkontrolle.
- Bereiten Sie das Allergen/Medikament in PBS-T mit dem 2-fachen der gewünschten Endkonzentration vor.
Anmerkung: Die optimalen Allergen-/Arzneimittelkonzentrationen müssen zuvor unter Verwendung eines breiten Konzentrationsbereichs, anhand von Dosis-Wirkungs-Kurven und durch Zytotoxizitätsstudien nach denselben Protokollschritten bestimmt werden.
>2. Vorbereitung der Färbemischung
- Monoklonale Antikörper, die mit Fluorochrom markiert sind, gemäß der vom Hersteller empfohlenen Antikörperkonzentration oder durch vorherige Antikörpertitration zum Stimulationspuffer hinzufügen. In diesem Protokoll fügen wir 1 μl jedes Antikörpers hinzu (CCR3-APC und CD203c-PE zur Identifizierung von Basophilen; CD63-FITC für die Aktivierung von Basophilen) pro 20 μl Stimulationspuffer.
Anmerkung: Schützen Sie die Fleckenmischungsvorbereitung vor Licht.
- Geben Sie 23 μl Färbemischung in jedes Röhrchen.
>3. Blutstimulation
- Geben Sie 100 μl PBS-T in die Röhrchen 1 und 2 (Negativkontrolle), 100 μl fMLP in die Röhrchen 3, 100 μl Anti-IgE in die Röhrchen 4 und 100 μl der verschiedenen Allergen-/Arzneimittelkonzentrationen in die folgenden Röhrchen. 10 min bei 37 °C in einem Thermostatbad unter mittlerem Rühren inkubieren, um die Reagenzien vorzuwärmen.
- Geben Sie vorsichtig 100 μl Blut in jedes Röhrchen, um eine Hämolyse zu vermeiden. Die Röhren vorsichtig vortexen und 25 min bei 37 °C in einem Thermostatbad mit mittlerer Bewegung inkubieren.
- Stoppen Sie die Degranulation und halten Sie die Röhrchen mindestens 5 Minuten lang bei 4 °C.
Anmerkung: Das Protokoll kann hier bei Bedarf bei 4 °C für 30-45 min pausiert werden.
>4. Lysierung von Erythrozyten
- Geben Sie 2 ml 1x Lysingpuffer in jedes Röhrchen, um die Erythrozyten zu lysieren. Jedes Röhrchen vortexen und 5 min bei RT.
inkubieren
Anmerkung: In diesem Schritt werden die Zellen durch die im Puffer enthaltenen Fixiermittel (Formaldehyd) fixiert.
- Bei 300 x g bei 4 °C 5 Min. zentrifugieren. Den Überstand dekantieren, dabei das Gestell in eine Senke umdrehen. Die Zellen verbleiben am Boden der Röhrchen.
- Geben Sie 3 ml PBS-T in jedes Röhrchen, um die Zellen zu waschen. Wirbeln Sie jedes Rohr ein.
- Bei 300 x g bei 4 °C 5 Min. zentrifugieren. Den Überstand dekantieren, dabei das Gestell in eine Senke umdrehen.
Anmerkung: Bewahren Sie die Proben bis zur Erfassung des Durchflusszytometers bei 4 °C vor Licht geschützt auf.
>5. Erfassung der Durchflusszytometrie
- Erfassen Sie Proben mit einem Durchflusszytometer (z. B. BD FACSCalibur Durchflusszytometer). Verbinden Sie das Durchflusszytometer mit der Computersoftware und warten Sie, bis das Zytometer bereit ist. Laden Sie die Vorlagen- und Instrumenteneinstellungen (Tabelle 1).
- Starten Sie die Probenerfassung.
- Verwenden Sie die folgenden Zytometer-Strategien für die Auswahl aktivierter Basophilen.
- Gate die Lymphozyten aus dem Side Scatter (SSC) - Forward Scatter (FSC) Plot.
- Gate die Basophilen aus der Lymphozytenpopulation als CCR3+CD203c+ Zellen. Erwerben Sie mindestens 500 Basophile pro Röhrchen.
- Zeigen Sie ein CCR3 - CD63-Diagramm an, um die Aktivierung mit CD63 als Aktivierungsmarker zu analysieren. Stellen Sie den negativen Schwellenwert für CD63 mit den negativen Kontrollröhrchen auf ca. 2,5 % ein.
- Entnehmen Sie alle Proben.
Tabelle 1: Anforderungen an Durchflusszytometer
| Lichtquellen (Laser) | Luftgekühlter Argon-Ionen-Laser Coherent SapphireTM mit 488 nm; luftgekühlter JDS UniphaseTM HeNe-Laser mit 633 nm; 17 mW |
| Stimulierende Wellenlänge des Lichts | Blauer Laser: 488 nm; Roter Laser: 633 nm |
| Leistung der Lichtquelle bei der exzitatorischen Wellenlänge | Blauer Laser: 20 mW; Roter Laser: 17 mW |
| Optische Filter | SSC: 488/10; FITC: 530/30, PE:585/42, APC: 660/20 |
| Optische Detektoren | FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC |
| Optische Detektoren | Luftgekühlter Argon-Ionen-Laser |
| Optische Pfade | BD-Achteck (488 nm Laserlinie); BD Trigons (633 nm Laserlinie) |