Analyse der Basophilenaktivierung in Gegenwart eines Testallergens mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Quelle: Doña, I. et al., Basophiler Aktivierungstest für die Allergiediagnose. J. Vis. (2021)

In diesem Video demonstrieren wir den Test zur Bewertung der Basophilenaktivierung in Gegenwart eines Testallergens mittels Durchflusszytometrie.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Probenvorbereitung

1. Sammeln Sie peripheres Blut in heparinisierten 9-ml-Röhrchen und halten Sie die Probe in einem Rotor bei Raumtemperatur (RT), bis sie für das Versuchsprotokoll benötigt wird.
2. Beschriften Sie 5-ml-Zytometerröhrchen für Negativkontrollen (2 Röhrchen), Positivkontrollen (2 Röhrchen) und unterschiedliche Konzentrationen von Allergenen/Arzneimitteln (1 Röhrchen pro getesteter Allergen-/Arzneimittelkonzentration). Legen Sie die Röhrchen in ein Gestell, in dem die Röhrchen perfekt passen, ohne zu verrutschen.
3. Bereiten Sie den Stimulationspuffer in doppelt destilliertem Wasser mit 2 % (v/v) HEPES, 78 mg/l NaCl, 3,7 mg/l KCl, 7,8 mg/l CaCl₂, 3,3 mg/l MgCl₂, 1 g/l HSA vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und fügen Sie IL-3 in einer Menge von 2 ng/ml hinzu. In der Regel 100 mL zubereiten und in 2,5 mL Aliquots aufteilen, um bei -20 °C eingefroren zu werden.
4. Positivkontrollen in PBS-Tween-20 0,05 % (v/v) (PBS-T): Positivkontrolle 1, N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP) (4 μM), zur Bestätigung der Qualität von Basophilen; Positivkontrolle 2, Anti-IgE (0,05 mg/ml) als IgE-vermittelte Positivkontrolle.
5. Bereiten Sie das Allergen/Medikament in PBS-T mit dem 2-fachen der gewünschten Endkonzentration vor.
   Anmerkung: Die optimalen Allergen-/Arzneimittelkonzentrationen müssen zuvor unter Verwendung eines breiten Konzentrationsbereichs, anhand von Dosis-Wirkungs-Kurven und durch Zytotoxizitätsstudien nach denselben Protokollschritten bestimmt werden.

>2. Vorbereitung der Färbemischung

1. Monoklonale Antikörper, die mit Fluorochrom markiert sind, gemäß der vom Hersteller empfohlenen Antikörperkonzentration oder durch vorherige Antikörpertitration zum Stimulationspuffer hinzufügen. In diesem Protokoll fügen wir 1 μl jedes Antikörpers hinzu (CCR3-APC und CD203c-PE zur Identifizierung von Basophilen; CD63-FITC für die Aktivierung von Basophilen) pro 20 μl Stimulationspuffer.
   Anmerkung: Schützen Sie die Fleckenmischungsvorbereitung vor Licht.
2. Geben Sie 23 μl Färbemischung in jedes Röhrchen.

>3. Blutstimulation

1. Geben Sie 100 μl PBS-T in die Röhrchen 1 und 2 (Negativkontrolle), 100 μl fMLP in die Röhrchen 3, 100 μl Anti-IgE in die Röhrchen 4 und 100 μl der verschiedenen Allergen-/Arzneimittelkonzentrationen in die folgenden Röhrchen. 10 min bei 37 °C in einem Thermostatbad unter mittlerem Rühren inkubieren, um die Reagenzien vorzuwärmen.
2. Geben Sie vorsichtig 100 μl Blut in jedes Röhrchen, um eine Hämolyse zu vermeiden. Die Röhren vorsichtig vortexen und 25 min bei 37 °C in einem Thermostatbad mit mittlerer Bewegung inkubieren.
3. Stoppen Sie die Degranulation und halten Sie die Röhrchen mindestens 5 Minuten lang bei 4 °C.
   Anmerkung: Das Protokoll kann hier bei Bedarf bei 4 °C für 30-45 min pausiert werden.

>4. Lysierung von Erythrozyten

1. Geben Sie 2 ml 1x Lysingpuffer in jedes Röhrchen, um die Erythrozyten zu lysieren. Jedes Röhrchen vortexen und 5 min bei RT.
   inkubieren Anmerkung: In diesem Schritt werden die Zellen durch die im Puffer enthaltenen Fixiermittel (Formaldehyd) fixiert.
2. Bei 300 x g bei 4 °C 5 Min. zentrifugieren. Den Überstand dekantieren, dabei das Gestell in eine Senke umdrehen. Die Zellen verbleiben am Boden der Röhrchen.
3. Geben Sie 3 ml PBS-T in jedes Röhrchen, um die Zellen zu waschen. Wirbeln Sie jedes Rohr ein.
4. Bei 300 x g bei 4 °C 5 Min. zentrifugieren. Den Überstand dekantieren, dabei das Gestell in eine Senke umdrehen.
   Anmerkung: Bewahren Sie die Proben bis zur Erfassung des Durchflusszytometers bei 4 °C vor Licht geschützt auf.

>5. Erfassung der Durchflusszytometrie

1. Erfassen Sie Proben mit einem Durchflusszytometer (z. B. BD FACSCalibur Durchflusszytometer). Verbinden Sie das Durchflusszytometer mit der Computersoftware und warten Sie, bis das Zytometer bereit ist. Laden Sie die Vorlagen- und Instrumenteneinstellungen (Tabelle 1).
2. Starten Sie die Probenerfassung.
3. Verwenden Sie die folgenden Zytometer-Strategien für die Auswahl aktivierter Basophilen.
   1. Gate die Lymphozyten aus dem Side Scatter (SSC) - Forward Scatter (FSC) Plot.
   2. Gate die Basophilen aus der Lymphozytenpopulation als CCR3⁺CD203c⁺ Zellen. Erwerben Sie mindestens 500 Basophile pro Röhrchen.
   3. Zeigen Sie ein CCR3 - CD63-Diagramm an, um die Aktivierung mit CD63 als Aktivierungsmarker zu analysieren. Stellen Sie den negativen Schwellenwert für CD63 mit den negativen Kontrollröhrchen auf ca. 2,5 % ein.
   4. Entnehmen Sie alle Proben.

Tabelle 1: Anforderungen an Durchflusszytometer

Lichtquellen (Laser)	Luftgekühlter Argon-Ionen-Laser Coherent SapphireTM mit 488 nm; luftgekühlter JDS UniphaseTM HeNe-Laser mit 633 nm; 17 mW
Stimulierende Wellenlänge des Lichts	Blauer Laser: 488 nm; Roter Laser: 633 nm
Leistung der Lichtquelle bei der exzitatorischen Wellenlänge	Blauer Laser: 20 mW; Roter Laser: 17 mW
Optische Filter	SSC: 488/10; FITC: 530/30, PE:585/42, APC: 660/20
Optische Detektoren	FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC
Optische Detektoren	Luftgekühlter Argon-Ionen-Laser
Optische Pfade	BD-Achteck (488 nm Laserlinie); BD Trigons (633 nm Laserlinie)

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, ohne Kappe, unsteril	Corning	352008
APC Anti-humaner CD193 (CCR3) Antikörper	BioLegende	310708
BD FACSCalibur Durchflusszytometer	BD Biowissenschaften
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. C1016
FITC Anti-Human-CD63 Antikörper	BioLegende	353006
HEPES (1 M)	Thermo-Fischer	15630106
Lysing Lösung 10x konzentriert	BD Biowissenschaften	349202
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M8266
N-Formyl-Met-Leu-Phe	Sigma-Aldrich	Nr. F3506
PE Anti-humaner CD203c (E-NPP3) Antikörper	BioLegende	324606
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. P9541
Gereinigtes Maus-Anti-Human-IgE	BD Biowissenschaften	555857
Rekombinantes humanes IL-3	F&E-Systeme	203-IL
Mantel-Flüssigkeit	BD Biowissenschaften	342003
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. S3014
RÖHRCHEN 9 mL LH Lithium-Heparin	Greiner Bio-One	455084
Tween 20	Sigma-Aldrich	Nr. P1379