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>1. Vorbereiten von Mikroinjektionsnadeln
- Bereiten Sie dünnwandige Glaskapillar-Injektionsnadeln (1,0 OD/0,75 ID) mit einem Mikropipettenabzieher mit den folgenden Einstellungen vor: Luftdruck 200, Hitze 502, Zug 90, Geschwindigkeit 80, Zeit 70, Luftzeit zu Beginn von Zug 5, Luftzeit am Ende von Zug 5.
- Brechen Sie mit einer feinen Pinzette die Spitze der gezogenen Nadel ab, so dass die Spitzenöffnung einen Durchmesser von ca. 10 μm hat.
>2. Vorbereiten von Larven-Injektionsschalen
- Spülen Sie einen Gelkamm mit einer Bahnbreite von ca. 4-5 mm in sterilem Wasser aus und lassen Sie ihn trocknen.
- Bereiten Sie eine 1,5-2%ige hochschmelzende Agaroselösung in E3-Medium vor und erhitzen Sie sie in der Mikrowelle, bis die Lösung klar ist. Nach dem Abkühlen etwas von der Agarose in eine Petrischale (100 x 15 mm) geben und schwenken, dabei gerade so viel Agarose hinzufügen, dass der Boden der Schale vollständig bedeckt ist.
- Sobald die Agaroseschicht erstarrt ist, legen Sie den gespülten und getrockneten Gelkamm darauf, so dass das ungekämmte Ende gerade auf der Oberseite der Petrischale aufliegt und das gekämmte Ende die Agarose berührt. Achten Sie darauf, dass der Kamm so horizontal wie möglich ist, wodurch ein Winkel von 30° in Bezug auf die untere Agaroseschicht entsteht.
- Gießen Sie eine zusätzliche kleine Menge Agarose an die Schnittstelle zwischen dem Kamm und der unteren Agaroseschicht, so dass die frische Agaroseschicht die Vertiefungen der Wabe bedeckt. Lassen Sie den Kamm vollständig abkühlen, bevor Sie ihn entfernen. Entfernen Sie mit einer Pipettenspitze alle überhängenden Agarosestücke aus den Vertiefungen.
- Gießen Sie E3-Medium auf die Spritzgussform und lagern Sie es bei 4 °C.
- Vor jedem Gebrauch mindestens eine Stunde vor der Injektion durch frisches Medium und warme Injektionsrampen bei 28,5 °C ersetzen.
- Unmittelbar vor der Injektion ist das E3 auf der Injektionsrampe durch ein E3-Medium zu ersetzen, das 200 μg/ml Ethyl-3-aminobenzoat (Tricain) enthält.
>3. Vorbereitung des Inokulums von Streptococcus iniae (S. iniae)
- Bereiten Sie Todd Hewitt Brühemedium mit 0,2 % Hefeextrakt und 2 % Proteose-Pepton (THY+P) vor und autoklavieren Sie es: 30 g/L Todd Hewitt, 2 g/L Hefeextrakt, 20 g/L Proteose-Pepton. Für Agarplatten 14 g/L Agar hinzufügen.
- Bereiten Sie Bakterienkulturen in der Nacht vor der Infektion vor, indem Sie ein 100 μl Aliquot gefrorener Bakterienbrühe in 10 ml THY+P-Bouillon in einem verschlossenen 15-ml-Röhrchen pipettieren. Über Nacht ohne Rühren bei 37 °C inkubieren. Nach 14-16 Stunden Wachstum verwenden Sie die Übernachtkultur entweder zur Herstellung von Gefrierbrühen oder zur Vorbereitung auf die Verwendung in Injektionen.
- Stellen Sie Gefrierbrühen her, indem Sie 1 ml der Übernachtkultur in 500 μl 80 % Glycerin in ein 1,7-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Um Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden, stellen Sie aus dieser Mischung 100 μl Einmal-Aliquots her und lagern Sie sie bei -80 °C.
- Bei S. iniae, das bei Infektionen verwendet wird, verdünnen Sie die Übernachtkultur 1:100 für ein Gesamtvolumen von 10 ml, indem Sie 0,1 ml Übernachtkultur zu 9,9 ml THY+P-Brühe hinzufügen. Anbau bei 37 °C ohne Rühren für ca. 4-5 Stunden. Überwachen Sie die optische Dichte (OD) bei 600 nm mit einem Nanodrop-Spektralphotometer und ernten Sie die Bakterien in einer mittleren logarithmischen Phase, wenn die OD600 nm 0,250-0,500 erreicht. Ein OD600 nm von 0,250 entspricht etwa 108 koloniebildenden Einheiten (KBE)/ml.
- 1 ml der Bakterienkultur in einem 1,7 ml Zentrifugenröhrchen bei 1.500 x g für 5 min pelletieren. In 1 ml frischer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendieren und wiederholen. Messen Sie die OD600 nm der Bakterien in PBS, pelletieren Sie sie und resuspendieren Sie sie in PBS, um die gewünschte Konzentration zu erreichen.
- Um die Visualisierung der Mikroinjektion zu erleichtern, fügen Sie den Bakteriensuspensionen vor der Injektion Phenolrot für eine Endkonzentration von 0,1 % hinzu.
- Bei Experimenten, bei denen hitzeabgetötete Bakterien injiziert werden, erhitzen Sie die Bakterien in PBS 30 Minuten lang auf 95 °C. Bestätigen Sie, dass der Hitzeabtötungsprozess die Anzahl lebensfähiger Bakterien auf ein nicht nachweisbares Niveau reduziert hat, indem ein Injektionsvolumen (ca. 1 nl) auf feste THY+P-Agarplatten aufgetragen und über Nacht bei 37 °C inkubiert wird.
>4. Markierung von S. inia emit einem CellTracker Red Fluoreszenzfarbstoff
- Um lebende Bakterienzellen zu markieren, bereiten Sie eine Stammlösung mit einem CellTracker-Fluoreszenzfarbstoff oder einem gleichwertigen Farbstoff vor. Da der verwendete Farbstoff in 20 x 50 μg Aliquoten Pulver vorliegt und in Dimethylsulfoxid (DMSO) resuspendiert werden muss, geben Sie 7,3 μl DMSO in das Röhrchen, um eine Stammkonzentration von 10 mM zu erhalten.
- Testen Sie eine Reihe von Farbstoffkonzentrationen (z. B. 0,5-25 μM) an den Bakterien, um die niedrigste optimale Konzentration zu bestimmen, die die Zellen färbt. Die schnelle Teilung von Zellen und längere Experimente können eine höhere Farbstoffkonzentration erfordern.
- 1,0 ml Bakterienkultur in einem 1,7-ml-Röhrchen durch Zentrifugation wie oben beschrieben (Abschnitt 3) auffüllen. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml frischem PBS und geben Sie die entsprechende Menge Farbstoff in die Bakterienkultur.
Ohne - Rühren 30 min bei 37 °C inkubieren. Die Bakterien einschleudern und in 1 ml vorgewärmter THY+P-Brühe resuspendieren und weitere 30 min bei 37 °C ohne Rühren inkubieren.
- Schleudern Sie die Bakterien herunter und waschen Sie sie zweimal in PBS, bevor Sie den OD600 nm messen und die Bakterien für die Mikroinjektion verdünnen, wie oben beschrieben (Abschnitt 3). In der Regel injizieren wir etwa 100 KBE in 1 nl Injektionsvolumen für unsere Studien zur Leukozytenrekrutierung und Phagozytose.
>5. Vorbereitung von Zebrafischlarven auf Infektionen
- Setzen Sie am Vorabend Zuchtpaare ein und sammeln Sie Embryonen, wie von Rosen et al. beschrieben.Inkubieren Sie die Embryonen in E3-Medium bei 28,5 °C, bis sie zur Infektion bereit sind.
- Verhindern Sie bei Zebrafischen, die abgebildet werden, die Entwicklung von Pigmenten (Melanisierung), indem Sie dem E3-Medium 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) N-Phenylthioharnstoff (PTU) für eine Endkonzentration von 0,2 nM hinzufügen.
- Bei Infektionen mit Embryonen, die 2 Tage nach der Befruchtung (dpf) alt sind, dechorionieren Sie die Embryonen manuell mit einer feinen Pinzette. Alternativ können Sie die Embryonen dechorionieren, indem Sie E3 entfernen und durch Pronase (2 mg/ml) für etwa 5 Minuten ersetzen oder bis die Embryonen durch sanftes Pipettieren aus dem Chorion herausbrechen. Die meisten Larven sollten auf natürliche Weise mit 3 dpf geschlüpft sein.
- Betäuben Sie den Zebrafisch einige Minuten vor der Infektion, indem Sie dechorionierte Larven in ein E3-Medium mit 200 μg/ml Tricain geben.
>6. Injektion von Etischem Vesikel von S. iniae in drei Tage alte Larven
- Schalten Sie den Mikroinjektor ein und stellen Sie den Zeitbereich auf "Millisekunde" ein. Öffnen Sie das Ventil am Kohlendioxidtank, um Gas in die Leitung zu lassen. Der Druck des Mikroinjektors sollte ungefähr 20 Pfund pro Quadratzoll (PSI) betragen. Stellen Sie den Druck in der Mikroinjektoreinheit ein, indem Sie den schwarzen Rändelknopf im Uhrzeigersinn drehen, um den Druck zu erhöhen, oder gegen den Uhrzeigersinn, um den Druck zu verringern.
- Die vorbereitete S. iniae-Kultur in Phenolrot und PBS vortexen und mit einer Microloader-Spitze 2-3 μl der Kultur in eine gezogene Kapillarinjektionsnadel laden.
- Montieren Sie die geladene Nadel auf einen Mikromanipulator, der mit einem Magnetstativ verbunden ist, und positionieren Sie ihn unter einem Stereomikroskop so, dass die Nadel in einem Winkel von etwa 45-65° zur Basis des Mikroskops steht.
- Drücken Sie auf das Fußpedal des Mikroinjektors, um einen Tropfen des Inokulums auf die Nadelspitze zu geben. Messen Sie den Durchmesser des Tropfens mit dem Maßstabsbalken in der Okularlinse des Mikroskops.
- Alternativ können Sie den Durchmesser des Tropfens schätzen, indem Sie mit einem Maßstabsbalken ein Volumen in einen Tropfen Mineralöl auf einem Glasobjektträger injizieren. Der Durchmesser des Tropfens sollte ca. 0,10 mm betragen, was etwa einem Volumen von 1 nl entspricht.
- Passen Sie die Tropfengröße an, indem Sie die Dauer am Mikroinjektor einstellen oder indem Sie mit einer feinen Pinzette einen größeren Teil der Nadelspitze abschneiden. Beachten Sie, dass die Injektionszeit zwischen 20 und 35 ms liegen sollte, um zu vermeiden, dass das Gewebe zu stark geschädigt wird.
- Übertragen Sie mit einer Kunststoff-Transferpipette 12 anästhesierte Larven in jede Vertiefung der Spritzgussform.
- Positionieren Sie die Larven vorsichtig mit einem Glasstab, einer Haarschlaufe oder einer Plastikspitze, sodass die Köpfe zur Rückseite des Mikroskops zeigen und die Dottersäcke an der linken Seite der Vertiefung anliegen. Richten Sie das linke Ohr der Larve nach oben zur Decke.
- Schauen Sie durch die Okularlinse des Stereomikroskops und richten Sie mit den Knöpfen am Mikromanipulator die geladene Nadel mit dem Vesikel oticus so aus, dass sich beide im gleichen Sichtfeld befinden. Durchstechen Sie mit der Nadelspitze die äußere Epithelschicht des Vesikels oticus, so dass sich die Nadelspitze gerade innerhalb des Vesikels befindet.
- Drücken Sie auf das Fußpedal, um 1 nl der gewünschten Dosis S. iniae zu injizieren. Achten Sie darauf, einen ausreichend niedrigen Druck zu verwenden, um den Hohlraum nicht zu platzen. Wenn die Injektion erfolgreich ist, sollte sich das Vesikel oticus, nicht aber das umgebende Gewebe, mit dem phenolroten Inokulum füllen (Abbildung 1 Ai). Entfernen Sie sofort alle falsch injizierten Fische aus der Injektionsplatte.
- Ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus der Larve heraus und bewegen Sie die Injektionsplatte mit der Hand, so dass die nächste Larve im Blick ist. Tun Sie dies unter 5-facher Vergrößerung.
Anmerkung: Das Zurückziehen der Nadel kann zur Ablagerung einiger Bakterien außerhalb des Vesikels führen, was das Überleben und die Rekrutierung von Leukozyten verzerren kann. Um dies zu vermeiden, wird empfohlen, fluoreszierende, farbstoffmarkierte Bakterien zu injizieren und die injizierten Larven unter einem Fluoreszenzmikroskop visuell zu scannen, um Larven zu entfernen, bei denen dies geschehen ist. Eine korrekt injizierte Larve ist in (Abbildung 1 Bi) dargestellt.
- Um sicherzustellen, dass das Injektionsvolumen/Inokulum im Verlauf des Experiments gleich bleibt, injizieren Sie nach jedem 48. Embryo einen Tropfen der Bakteriensuspension in ein 1,7-ml-Zentrifugenröhrchen mit 100 μl sterilem PBS. Die 100 μl werden über Nacht auf THY+P-Agarplatten bei 37 °C plattiert, um die KBE im Injektionsvolumen zu bestimmen.
- Wenn die gesamte Gruppe von 12 Larven auf der Injektionsrampe injiziert wurde, entnehmen Sie die Larven vorsichtig mit einer Kunststoff-Transferpipette aus den Vertiefungen und legen Sie sie in eine neue Petrischale (35 x 10 mm2). Entfernen Sie die Tricainlösung und ersetzen Sie sie durch ca. 2 ml frisches E3-Medium, damit sich die Larven erholen können.
- Pipettieren Sie die Larven in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte und inkubieren Sie sie bei 28,5 °C. Überwachen Sie die Larven im Laufe der Zeit auf ihr Überleben in diesen Platten oder entfernen Sie sie später für die Bildgebung oder KBE Zählungen.
>7. Fixierung von Larven für die Bildgebung
- Die Larven werden in einem eiskalten 4%igen Paraformaldehyd in PBS-Lösung fixiert, wie in Abschnitt 7 beschrieben.
- Bei Raumtemperatur vor der Bildgebung 3 Mal für jeweils 5 Minuten in PBS waschen.
>8. Vorbereitung der Larven für die Live-Bildgebung
- Bereiten Sie eine 1,5%ige Agaroselösung mit niedrigem Schmelzpunkt in E3 vor, indem Sie sie in der Mikrowelle erhitzen, bis die Lösung klar ist.
- Geben Sie die Agaroselösung in ein 55 °C heißes Wasserbad, um sie abkühlen, aber nicht aushärten zu lassen.
- Gicain zur Agarose bis zu einer Endkonzentration von 0,016 % hinzufügen.
- Legen Sie mit einer Kunststoff-Transferpipette 4-5 betäubte Larven in eine Glasbodenschale auf den Tisch eines Stereomikroskops.
- Die Tricain-Agarose-Lösung aus dem 55 °C warmen Wasserbad nehmen und 1-2 min bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Während die Agarose abkühlt, entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich aus den betäubten Larven.
- Die abgekühlte Agarose in die Form geben, bis etwa die Hälfte der Oberfläche bedeckt ist. Die Form schwenken, um die Agarose zu verteilen. Beachten Sie, dass die Agarose, wenn sie zu heiß ist, die Larven tötet. Wenn der Schale zu viel Agarose zugesetzt wird, kann die Objektivlinse des Mikroskops beim Fokussieren durch die Agarose auf den Boden der Schale treffen.
- Nehmen Sie mit einer Transferpipette die Larven auf, die an den Seiten der Schale geschwommen sind, und pipettieren Sie sie zurück in die Mitte.
- Positionieren Sie die Larven unter dem Stereomikroskop vorsichtig wie gewünscht mit einer Haarschlaufe, einer langen Pipettenspitze oder einem Glasstab. Positionieren Sie die Larven für die Darstellung des Vesikels so, dass das linke Vesikel flach am Boden der Schale anliegt.
- Lassen Sie die Agarose ca. 10 Minuten abkühlen, bevor Sie die Form bewegen. Die Larven können ihre Position wechseln, wenn die Agarose nicht fest ist. Pipettieren Sie vorsichtig etwas Tricain und E3-Lösung auf die Oberseite der Agaroseschicht, um sie feucht zu halten.
>9. Konfokale Bildgebung von Infektionen
- Stellen Sie die Glasbodenschale mit den Larven auf den Tisch eines inversen Mikroskops mit einem konfokalen Laserscanning-System FV-1000.
- Stellen Sie die Lochblende auf 200-300 μm ein und stellen Sie mit einem Objektiv mit numerischer Apertur von 0,75/20x Z-Stapel mit 3-6 μm-Schichten ein.
- Verwenden Sie kontinuierliches Zeilenscannen, um die Laserleistung und die Detektorverstärkung für jeden Kanal anzupassen.
- Unter Verwendung von sequentieller Zeilenabtastung für jeden Fluoreszenzkanal (z. B. 488 und 543 nm) und differentiellem Interferenzkontrast (DIC) führen Sie alle 3 Minuten für 2-6 Stunden einen Zeitrafferfilm des linken otischen Vesikels durch, um die anfängliche Rekrutierung und Phagozytose durch Neutrophile und Makrophagen zu beobachten. Legen Sie bei längeren Kursen einen Deckel auf die Petrischale, um ein Verdunsten und Austrocknen der Agarose zu verhindern.
- Nehmen Sie Standbilder von festen (Abbildung 1B) oder lebenden (Abbildung 2) Larven mit 20- oder 40-facher Vergrößerung auf.
10. Photokonversion von Dendra2-markierten Leukozyten am otischen Vesikel
HINWEIS: Dendra2 kann von grüner in rote Fluoreszenz photokonvertiert werden, indem ein 405-nm-Laser (50-70% Laserleistung sollte ausreichend sein) für 1 Minute auf die Region of Interest (ROI) fokussiert wird. Nachfolgend finden Sie das Schritt-für-Schritt-Protokoll, das für das konfokale Laserscanning-System FV-1000 verwendet wird:
- Visualisieren Sie die Probe mit einem Z-Stack-Scan mit den Lasern 488 nm und 543 nm. Verwenden Sie die kontinuierliche Zeilenabtastung, um die Laserleistung und die Detektorverstärkung anzupassen. Stellen Sie sicher, dass keine versehentlich photokonvertierte rote Fluoreszenz vorliegt.
- Wählen Sie im Fenster "Bildaufnahmesteuerung" unter "Stimulus-Einstellung" das Werkzeug "Scanner verwenden" und wählen Sie "Haupt". Wählen Sie den 405-nm-Laser aus und stellen Sie ihn auf 70 % Leistung ein. Definieren Sie mit der Kreisoption den ROI im otischen Vesikel.
- Wählen Sie unter "Stimulus Start Setting" die Option "Aktivierung in Serie" mit einer Voraktivierung von 1 Frame und einer Aktivierungszeit von 60.000 ms. Wählen Sie im Fenster "Aufnahmeeinstellung" unter der Überschrift "Zeitscan" 2 Intervalle von 00:01:00 (eines für die Vor- und eines für die Nach-Fotokonvertierung).
Anmerkung: Nachdem der Zeitraffer-Serienscan abgeschlossen ist, sollte der Dendra2 in seinen rot fluoreszierenden Zustand photokonvertiert worden sein.
- Scannen Sie die Probe mit einem Z-Stapel mit den Lasern 488 nm und 543 nm, um die photokonvertierte rote Fluoreszenz sowie die verbleibende grüne Fluoreszenz zu visualisieren (Abbildung 3).
