>1. Durchflusszytometrie und Sortierung von Lymphozyten-Subtypen
HINWEIS: Das Sortieren von Lymphozyten in Abhängigkeit vom Zelltyp ist essentiell für die Etablierung der grundrichtigen (d.h. korrekten) Zelltyp-Markierungen, um einen Zelltyp-Klassifikator im überwachten Lernen zu trainieren und zu testen. Die Durchflusszytometrie, eine Goldstandardmethode, wird zur Identifizierung und Trennung von Lymphozyten eingesetzt.
- Stellen Sie eine Mischung aus Antikörpern zur Oberflächenmarkerfärbung in 100 μl frischem RPMI-1640-Medium [mit 10 % FBS, 0,1 μg CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D3), CD45R (B220, RA3-6B2) und NK1.1 (PK136)] und 0,25 μg CD4 (GK1,5)-Antikörpern her, um B-, CD4+ T- und CD8+ T-Lymphozyten zu adressieren.
- Geben Sie 100 μl des Antikörpergemisches in die Zellsuspension.
- 25 min auf Eis inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen, indem Sie 5 mL PBS hinzufügen und zweimal 5 Minuten lang bei 4 °C bei 400 x g zentrifugieren.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 mL frischem RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS und 2,5 μg DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol).
- Sammeln Sie jeden Lymphozytentyp separat mit Durchflusszytometrie unter Verwendung der Fluoreszenzwerte der oben beschriebenen Marker. Schließen Sie gleichzeitig tote Zellen mithilfe der DAPI-Signale aus.
2. 3D Quantitative Phasenbildgebung
- Halten Sie die sortierten Lymphozyten während der gesamten Bildgebung auf Eis, die innerhalb von 5 Stunden abgeschlossen sein sollte (da die Lymphozyten aus der Maus isoliert wurden), um Zellschäden und biochemische Veränderungen zu vermeiden.
- Wählen Sie einen sortierten Zelltyp (zwischen B-, CD4+ T- und CD8+ T-Lymphozyten) und verdünnen Sie die Probe auf 180 Zellen/μl mit RPMI-Medium, um optimale Bildgebungsbedingungen zu erzielen (d. h. eine Zelle pro einzelnem Sichtfeld).
- Laden Sie 120 μl der verdünnten Probe durch langsame Injektion in eine Bildgebungskammer. Überprüfen Sie gründlich das Vorhandensein von Blasen in der Bildgebungskammer mit der Probe. Wenn Blasen vorhanden sind, entfernen Sie diese vorsichtig, da sie die Qualität der Messungen beeinträchtigen.
- Erfassen Sie 3D-RI-Tomogramme mit einem kommerziellen quantitativen 3D-Phasenmikroskop oder Holotomographie und seiner Bildgebungssoftware.
HINWEIS: Detaillierte Informationen zum Versuchsaufbau finden Sie im Originalmanuskript.
- Geben Sie einen Tropfen destilliertes Wasser auf die Objektivlinse des Mikroskops.
- Platzieren Sie die Bildgebungskammer mit der Probe auf dem Translationstisch des Mikroskops und stellen Sie ihre Position so ein, dass die Probe mit der Objektivlinse ausgerichtet ist.
- Passen Sie die axialen Positionen des Objektivs und der Kondensorlinsen an, indem Sie auf der Registerkarte "Kalibrierung" in der Perspektive "Mikroskop" der Bildgebungssoftware auf Fokus bzw. Oberfläche klicken.
- Richten Sie das Objektiv und die Kondensorlinsen aus, indem Sie auf Automatikmodus klicken. Alternativ können Sie den Scanmodus verwenden und die Objektive manuell so einstellen, dass die Beleuchtungsmuster im zentralen Bereich des Sichtfelds lokalisiert werden.
- Kehren Sie in den Normalmodus zurück und passen Sie die Verschiebungsstufe an, um eine Zelle im Sichtfeld zu platzieren.
- Finden Sie die Fokusebene, indem Sie die axiale Position der Objektivlinse anpassen. Durch die perfekte Fokussierung wird die auf dem Bildschirm sichtbare Probengrenze nahezu unsichtbar.
- Passen Sie die Übersetzungsphase an, um eine Position ohne Zelle zu finden.
- Klicken Sie auf Kalibrieren, um mehrere 2D-Hologramme mit unterschiedlichen Beleuchtungswinkeln zu messen.
- Passen Sie die Verschiebungsstufe so an, dass sich eine Zelle in der Mitte des Sichtfelds befindet.
- Wechseln Sie zur Registerkarte "Erfassung" und klicken Sie auf 3D-Schnappschuss, um die Hologramme der Zelle mit identischen Beleuchtungswinkeln zu messen, wie in Schritt 2.4.8 beschrieben.
- Wenn die erfassten Daten im Bereich "Datenverwaltung" angezeigt werden, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die erfassten Daten und klicken Sie auf Verarbeiten, um ein 3D-RI-Tomogramm aus den in den Schritten 2.4.8 und 2.4.10 gemessenen Hologrammen unter Verwendung des in der Bildgebungssoftware implementierten Beugungstomographie-Algorithmus zu rekonstruieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.4.5 bis 2.4.11, um mehr als 100 Zellen zu messen und so die statistische Aussagekraft für maschinelles Lernen sicherzustellen.
- Alle Bilder, die durch Schritt 2.4.11. bearbeitet werden, können visualisiert werden. Klicken Sie im Bereich "Datenverwaltung" mit der rechten Maustaste auf die Daten und klicken Sie auf Öffnen, um die Daten zu visualisieren. Klicken Sie im Bereich "Datenmanager" auf RI-Tomogramm. Klicken Sie auf der Registerkarte "Preset" auf "Laden" und doppelklicken Sie auf "lymphocyte.xml", eine vordefinierte Übertragungsfunktion, die von der Bildgebungssoftware bereitgestellt wird, um das Tomogramm gemäß den 3D-RI-Verteilungen zu visualisieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2 bis 2.4, um 3D-RI-Tomogramme aller Lymphozyten-Subtypen zu messen.
