Alle Verfahren, bei denen Proben entnommen werden, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt
>1. Blutentnahme von Patienten
VORSICHT: Ergreifen Sie geeignete Sicherheitsmaßnahmen im Labor, wenn Sie Vollblut vom Patienten entnehmen. Tragen Sie Handschuhe und eine Brille. Wenn sich der Patient in Isolation befindet, befolgen Sie bitte die Verfahren der Biosicherheitsstufe 4.
- Um dem Patienten intravenös Vollblut zu entnehmen, verwenden Sie eine Schmetterlingsnadel mit einem Verlängerungsschlauch mit kleinem Durchmesser und einen Blutentnahme-Vakuumröhrchen, das einen Lyse-/Bindungspuffer enthält. Legen Sie den Arm des Patienten in eine nach unten gerichtete Position und positionieren Sie das Entnahmeröhrchen tiefer als die Schmetterlingsnadel. Führen Sie die Schmetterlingsnadel in die Vene des Patienten ein und befestigen Sie den Blutentnahme-Vakuumschlauch an der kleinen Verlängerung.
Anmerkung: Dadurch wird ein Rückfluss verhindert.
- Mischen Sie nach der Blutentnahme den Inhalt des Röhrchens, indem Sie das Röhrchen 5 - 10 Mal wenden.
Anmerkung: Aufgrund des verbleibenden Vakuums im Blutentnahmeröhrchen, das 1,6 ml Lyse-/Bindungspuffer enthält, beträgt das Volumen der entnommenen Probe automatisch 1,6 ml.
- Desinfizieren Sie die Außenseite des Rohrs mit 70% Ethanol.
- Inkubieren Sie die Röhrchen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Anmerkung: Hier kann das Protokoll pausiert werden und die vollen Blutentnahmeröhrchen können bei -20 °C, 5 °C, 25 °C oder 37 °C für mindestens 1 Monat gelagert werden.
- Fahren Sie direkt mit der vereinfachten NA-Extraktionsmethode fort.
>2. Vereinfachte NA-Extraktion des Vollbluts
- Um NA aus dem durch Lyse-/Bindungspuffer inaktivierten gesammelten Blut zu reinigen, mischen Sie den Inhalt des Röhrchens, indem Sie das Vakuumröhrchen 5 - 10x von Hand wenden.
- Nehmen Sie den Deckel des Röhrchens vorsichtig ab und entleeren Sie den Deckel.
- Gießen Sie das vorbereitete Aliquot von MGPs (1 ml) direkt in das Blutentnahmeröhrchen.
- Setzen Sie einen neuen Deckel aus einem unbenutzten Blutentnahmeröhrchen auf das Röhrchen mit der Probe.
- Legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass das Röhrchen fest verschlossen ist, und mischen Sie den Inhalt des Röhrchens, indem Sie das Blutentnahmeröhrchen 5 - 10 Mal mit der Hand umdrehen.
- Legen Sie die Tube in die Magnethalterung und halten Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass die Tube fest verschlossen ist.
- Drehen Sie den Magnethalter mit der Röhre einige Male von Hand um, um sicherzustellen, dass alle MGPs an der Seite der Röhre mit dem Magneten gesammelt werden.
Anmerkung: Die Magnethalterung kann durch einen länglichen Magneten und ein Gummiband ersetzt werden.
- Entfernen Sie den Deckel des Röhrchens und entsorgen Sie den Inhalt des Röhrchens, indem Sie entweder eine Einwegpipette verwenden oder den Inhalt einfach in ein 50-ml-Auffangröhrchen gießen.
Anmerkung: Vermeiden Sie Aerosole aus dem 50-ml-Auffangröhrchen, indem Sie das Röhrchen mit einem Deckel verschließen.
- Gießen Sie das vorbereitete Aliquot des Waschpuffers-1 (WB-1, 4 mL) direkt in das Blutentnahmeröhrchen.
- Setzen Sie den Deckel auf die Tube und legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass die Tube fest verschlossen ist.
- Nehmen Sie die Tube aus der Magnethalterung und halten Sie den Deckel mit einem Finger fest fest.
Anmerkung: Wenn Sie einen Magneten und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und den Magneten aus dem Rohr.
- Resuspendieren Sie die MGPs, indem Sie das Blutentnahmeröhrchen 5 - 10 Mal von Hand umdrehen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.6 - 2.8.
- Gießen Sie das vorbereitete Aliquot von WB-2 (1,5 ml) direkt in das Blutentnahmeröhrchen.
- Setzen Sie den Deckel auf die Tube und nehmen Sie die Tube aus der Magnethalterung.
Anmerkung: Wenn Sie einen Magneten und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und den Magneten aus dem Rohr.
- Legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass die Tube fest verschlossen ist.
- Suspendieren Sie die MGPs, indem Sie das Blutentnahmeröhrchen einige Sekunden lang von Hand umdrehen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.6 - 2.8.
- Gießen Sie das vorbereitete Aliquot von WB-3 (3 ml) direkt in das Blutentnahmeröhrchen.
- Setzen Sie den Deckel auf die Tube und nehmen Sie die Tube aus der Magnethalterung.
Anmerkung: Wenn Sie einen Magneten und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und den Magneten aus dem Rohr.
- Legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass die Tube fest verschlossen ist.
- Resuspendieren Sie die MGPs, indem Sie das Blutentnahmeröhrchen 5 - 10 Mal von Hand umdrehen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.6 - 2.8.
- Gießen Sie das vorbereitete Aliquot des Elutionspuffers (EB, 100 μL) direkt in das Blutentnahmeröhrchen.
- Setzen Sie den Deckel auf die Tube und nehmen Sie die Tube aus der Magnethalterung.
Anmerkung: Wenn Sie einen Magneten und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und den Magneten aus dem Rohr.
- Resuspendieren Sie die MGPs im EB, indem Sie 5 - 10 Mal mit dem Finger auf das Blutentnahmeröhrchen klopfen.
Anmerkung: Hier kann das Protokoll pausiert und die Röhrchen bei -20 °C gelagert werden.
- Ein Tröpfchen (5 - 8 μl) der resuspendierten MGPs wird mit einer 1,5-ml-Einwegpipette in das nachgeschaltete NA-Amplifikationsreaktionsgemisch überführt (es kann ein beliebiger nachgeschalteter diagnostischer NA-Amplifikationsassay wie z. B. schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP)/ Reverse-Transkriptions-LAMP (RT-LAMP) oder quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)/RT-qPCR-Assays verwendet werden).
Anmerkung: Die NAs bleiben an den MGPs haften, also stellen Sie sicher, dass Sie die MGPs in der nachgeschalteten NA-Amplifikationsreaktion verwenden. Mischen Sie die MGP-Suspension vor Gebrauch. Nach dem Mischen sammeln sich die MGPs am Boden des Röhrchens.
