$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Herstellung von Liposomen
- Berechnen Sie die Menge an chloroform-suspendierten Stammlösungen von 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-cap-Biotinyl (Biotin-PE), um verdünnte Stammstoffe in der gewünschten Endkonzentration herzustellen. Um Endkonzentrationen von 400 μM DOPC und 80 μM Biotin-PE Phospholipiden zu je 10 ml zu erhalten, beginnen Sie damit, 629 μl 10 mg/ml DOPC und 88 μl 10 mg/ml Biotin-PE in separate Glaschromatographie-Röhrchen zu geben.
HINWEIS: Es ist wichtig, Hamilton-Glasspritzen und Glaschromatographie-Röhrchen mit Reinigungslösung (1 l 95%iges Ethanol auf 120 ml Wasser mit 60 g Kaliumhydroxid, KOH) zu reinigen, während die chloroform-suspendierte Stammlösung von DOPC und Biotin-PE umgefüllt wird.
- Trocknen Sie das Chloroform mit einem Strahl Argon in der chemischen Haube. Verschließen Sie das Chromatographie-Röhrchen mit Parafilm.
- Setzen Sie die frisch getrockneten Liposomen über Nacht einem Hochvakuum in einem Lyophilisator (O/N) aus, um Reste von Chloroform zu entfernen. Für die Fertigstellung am selben Tag 60-90 Minuten trocknen.
- Während der Gefriertrockner läuft, bereiten Sie etwas Verdünnungspuffer vor. Bereiten Sie für dieses Protokoll 25 ml bestehend aus 25 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl; und 2 % (nach Gewicht) n-Octyl-β-D-Glucopyranosid (OG)-Detergens. Mischen Sie zuerst die ersten beiden Zutaten miteinander, verdrängen Sie dann Sauerstoff durch Argon, bevor Sie das trockene OG-Pulver hinzufügen. Nach der Zubereitung die OG-Lösung mit einer 0,2-Mikron-Celluloseacetat-Membran filtrieren und bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie außerdem zwei Schraubflaschen mit 1 l Tris-Kochsalzpuffer in den gleichen Konzentrationen, jedoch ohne OG vor. Setzen Sie jeweils einen mit destilliertem Wasser gereinigten magnetischen Rührstab in den Boden ein. Bereiten Sie 6 zusätzliche Liter des Tris-Kochsalzpuffers vor. Entfernen Sie den Sauerstoff aus allen Flaschen mit Argon und stellen Sie sie ebenfalls auf 4° C.
- Nach der Lyophilisierung lösen Sie die getrockneten Lipide im Tris-Kochsalzlösung OG-Puffer auf, um jeweils eine 4 mM-Lösung herzustellen. Geben Sie gemäß den Beispielvolumina 2 ml in das DOPC-Röhrchen und 0,2 ml in das Biotin-PE-Röhrchen.
- Mischen Sie die Biotin-PE-Lipide mit den DOPC-Lipiden. Dies verbessert die Beweglichkeit des SLB, da das gekoppelte Biotin die Fließfähigkeit der Phosphatkopfgruppen beeinträchtigen kann. Um eine Endkonzentration von 80 μM Biotin-PE zu erhalten, mischen Sie 0,2 ml 4 mM Biotin-PE und 1 ml 4 mM DOPC. Fügen Sie dann 8,8 ml des Tris-Kochsalzlösung OG-Puffers hinzu.
- Für eine Endkonzentration von 400 μM DOPC mischen Sie einfach 1 ml 4 mM DOPC mit 9 ml Tris-Kochsalzlösung OG.
- Füllen Sie den Ultraschallgerät mit Eiswasser. Setzen Sie das Glasröhrchen mit dem verdünnten Phospholipid mit einer Versorgungsklemme in die Mitte des Ultraschallgeräts. Das verdünnte Phospholipid wird 10 Minuten lang beschallt, bis die Lösung klar wird.
Anmerkung: Geben Sie Eis in das Wasserbad des Ultraschallgeräts, um die Temperatur niedrig zu halten, da die Beschallung Wärme erzeugt.
- Füllen Sie die Röhrchen mit Argon, um den Sauerstoff in der Luft der Flüssigkeit zu verdrängen, und verschließen Sie sie mit Parafilm.
>2. Dialyse von Liposomen
- Schneiden Sie zwei Abschnitte trockener Dialyseschläuche (Molekulargewichtsgrenze: 12-14.000, Durchmesser: 6,4 mm) mit geeigneter Länge (in diesem Beispiel 40 cm), einen für jede Phospholipidverdünnung, von der Rolle ab.
- Rehydrieren Sie die Schlauchabschnitte, indem Sie sie 2 Minuten lang in 200 ml destilliertem Wasser in einem Becherglas einweichen lassen.
- Mikrowelle für 5 Minuten auf hoher Stufe oder zumindest bis das Wasser zum Kochen kommt.
- Binden Sie an einem Ende jeder Tube einen Knoten und spülen Sie das Innere mit einigen Millilitern Tris-Kochsalzlösung-OG-Puffer aus. Drücken Sie danach so viel wie möglich von diesem Waschpuffer sorgfältig aus, um die Menge des im Inneren verbleibenden Puffers zu minimieren.
- Geben Sie in einer Laminar-Flow-Haube die verdünnten Phospholipide in jedes Röhrchen und klemmen Sie die offenen Enden mit einem kleinen Verschluss des Dialyseschlauchs fest, um jegliche Luft auszuschließen. Ein vollständiger Luftausschluss erfordert die Opferung eines kleinen Volumens der Probe durch Einklemmen unterhalb der "Wasserlinie".
- Tauchen Sie die Proben in die zuvor vorbereiteten Flaschen mit Tris-Kochsalzpuffer ohne OG. Sauerstoff in der Flasche durch Argon ersetzen, bevor sie wieder verschlossen wird, und O/N bei 4 °C unter Rühren stellen.
- Füllen Sie den Schlauch mindestens 3 Mal alle 12 Stunden in eine neue Flasche Tris-Kochsalzpuffer ohne OG um.
- Kurz vor der Entnahme der dialysierten Lipide bereiten Sie eine Anzahl kleiner Röhrchen vor, in die die Lipide aliquotiert werden, indem Sie jedes mit Argon füllen, um den Sauerstoff zu verdrängen.
- Nehmen Sie nach 36 h die Dialyseflaschen in die Laminar-Flow-Haube und entfernen Sie die Dialyseschläuche aus den Flaschen. Halten Sie eine Bankwindel oder einen Becher bereit, um den nassen Abfluss aufzufangen.
- Schneiden Sie den Dialyseschlauch über dem Clip ab, entfernen Sie den Clip und übertragen Sie die dialysierte Lipidlösung vorsichtig per Pipette in 1 ml Aliquote in vorbereitete Röhrchen, die mit Argongas auf Eis gefüllt sind.
- Aliquotieren Sie die wässrige Liposomenlösung und verwenden Sie den Argonstrom, um den Sauerstoff in jedem Röhrchen wieder zu verdrängen.
- Lagern Sie die Liposomen bei 4°C. Nicht einfrieren.
>3. Isolierung und Kultivierung menschlicher NK-Zellen
- Aliquotieren Sie 15 ml peripheres Blut oder Buffy Coat in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Verdünnen Sie dieses Blut mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 1 % fötales Rinderserum (FBS) im Verhältnis 1:1 enthält.
- Geben Sie 13 ml Ficoll vorsichtig mit einer 10 ml serologischen Pipette auf den Boden des Röhrchens.
- Zentrifugieren Sie dieses Röhrchen 20 Minuten lang bei 1.200 x g mit dem Beschleuniger und dem Break-off oder auf der niedrigsten Stufe.
- Verwenden Sie nach der Zentrifugation eine serologische Pipette, um die schwebende trübe weiße mittlere Schicht der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) zu sammeln, die sitzen sollte, und den Schnittpunkt zwischen einer klaren gelben oberen Schicht und einer trüberen, blassfarbenen unteren Schicht, die beide über einer untersten Schicht roter Blutkörperchen (RBCs) sitzen. HINWEIS: Sammeln Sie keine RBCs beim Sammeln der PBMCs.
- Geben Sie die gesammelten PBMCs in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen und verdünnen Sie sie bis zum Fassungsvermögen mit PBS, das 1 % FBS enthält. Erneut zentrifugieren, diesmal mit Bremse und Gaspedal auf Maximum, für 5 min bei 300 x g.
- Den Überstand verwerfen und die Zellen in 10 ml PBS mit 1 % FBS resuspendieren.
- Zählen Sie die Zellen während der Zentrifugation erneut mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 3.6.
- Der Überstand wird erneut verworfen und die Zellen in R10-Medium mit einer Dichte von 10 Millionen Zellen/ml resuspendiert.
- Nehmen Sie 30 Millionen Zellen in einem 5-ml-Polystyrolröhrchen und isolieren Sie NK-Zellen mit einem magnetischen Trennkit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach der Isolierung werden die Zellen noch einmal gezählt und bei einer Dichte von 500.000 Zellen/ml in R10-Vollmedium (88 % Roswell Park Memorial Institute Medium, RPMI; 10 % FBS; 1 % N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure, HEPES; 1 % Natriumpyruvat) ergänzt, ergänzt mit IL-2 (100 U/ml) resuspendiert. Kultivieren Sie bei 37° in einem CO2 -Inkubator und wechseln Sie das Medium 2-3 Mal wöchentlich.
>4. Zusammenbau der glasgestützten planaren Lipid-Doppelschicht
- 100 ml Piranha-Lösung durch Mischen von 30%igem Wasserstoffperoxid mit Schwefelsäure im Verhältnis 1:3 in einem Becherglas herstellen.
Anmerkung: Arbeiten Sie mit Schadstoffen wie Schwefelsäure immer in einem dafür vorgesehenen chemischen Abzug.
- Tauchen Sie in diese Lösung 2 rechteckige #1,5 Deckgläser für 20-30 Min.
Anmerkung: Es ist wichtig, die Deckgläser mit einer Piranha-Lösung zu reinigen.
- Während die Deckgläser gereinigt werden, wird 1 Tube mit zuvor aufbereiteten 400 μM DOPC-Lipiden und 1 Tube mit zuvor aufbereiteten 80 μM Biotin-PE-Lipiden entnommen. Transportiere sie auf Eis zum Argontank.
- Verdrängen Sie den Sauerstoff in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen mit Argon und fügen Sie dann DOPC und Biotin-PE im Verhältnis 1:1 hinzu. Das spezifische Volumen variiert je nach experimentellem Bedarf, sollte jedoch mindestens 2 μl pro Stück betragen. Der Sauerstoff im Gemischröhrchen wird erneut durch Argongas ersetzt, ebenso wie die einzelnen Reagenzröhrchen, bevor diese wieder in den Kühlschrank gestellt werden.
- Spülen Sie die Deckgläser nach der Reinigung gründlich mit destilliertem Wasser ab. Legen Sie die Deckgläser einige Minuten lang an der Luft trocknen.
- 1,5 μl des in Schritt 5.4 hergestellten Liposomengemisches werden entnommen und in einem einzigen Tropfen in eine der Bahnkammern des Kammerobjektträgers aliquotiert. Die Verwendung von 2 Drops pro Bahn ist typisch, aber nicht notwendig.
- Legen Sie das trockene Deckglas schnell und effizient über die Tröpfchen. Achten Sie darauf, dass die Tropfen ausreichend Abstand haben, damit sie nach dem Auflegen des Deckglases nicht miteinander verschmelzen. Achten Sie außerdem darauf, dass die Tropfen kreisförmig und gut definiert bleiben, ohne die Ränder der Kammerwände zu berühren. Drücken Sie zwischen und um jede Bahn herum fest nach unten, um eine wasserdichte Abdichtung zwischen Deckglas und Schieber zu gewährleisten.
- Markieren Sie die Positionen der Tropfen mit einem Markierungsstift.
- 100 μl wässriges 5%iges Kasein werden durch die Kammer geleitet, um die Doppelschicht zu blockieren. Versuchen Sie sicherzustellen, dass sich keine Blasen in der Strömungskammer befinden.
- 100 μl Streptavidin in einer Konzentration von 333 ng/ml in jede Spur injizieren. 10-15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Nach dem Waschen 3 ml HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (HBS)/1 % Humanserumalbumin (HSA) durch jede Spur laufen lassen, um das überschüssige Streptavidin zu entfernen.
- Zugabe von 100 μl biotinyliertem, fluoreszenzmarkiertem Anti-CD16 wie Alexa Fluor 568 in der Proteinkonzentration, die zuvor als am wirksamsten bestimmt wurde. 20-30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Waschen Sie erneut, indem Sie 3 ml HBS/1 % HSA durch jede Bahn laufen lassen.
- 100 μl D-Biotin in einer Konzentration von 25 nM durch die Kammer fließen, um überschüssiges Streptavidin zu binden und so die Möglichkeit einer unspezifischen Bindung von Streptavidin an die Zellen auszuschließen.
- Zählen Sie NK-Zellen und resuspendieren Sie sie in einer Konzentration von 500.000/ml in HBS/1 % HSA.
- Während Sie die Zellen herunterschleudern, waschen Sie das D-Biotin mit weiteren 3 ml HBS/1% HSA pro Bahn aus der Kammer.
- Überprüfen Sie die Beweglichkeit der Liganden auf dem SLB durch Fluoreszenz-Recovery nach Photobleaching (Fluoreszenz-Recovery nach Photobleaching, FRAP) an einer Totalreflexionsfluoreszenz (TIRF) oder konfokale Mikroskopie vor der Zugabe von NK-Zellen.
- Sobald sich die Zellen nicht mehr drehen und in der gewünschten Konzentration resuspendiert wurden, fügen Sie jeder Bahn 100 μl hinzu.
- Stellen Sie die Kammer für 30-60 min in einen 37° 5% CO2 -Inkubator.
- Nach dieser Inkubationszeit fixieren Sie die Zellen 10-20 Minuten lang mit 4% Paraformaldehyd bei RT. Waschen Sie, indem Sie 3 ml PBS durch jede Bahn laufen lassen, um das Paraformaldehyd zu entfernen.
- Fügen Sie 400 μl Blockierungspuffer hinzu (5 % normales Eselserum und 0,2 % Triton X-100 in PBS). 30 Minuten bei RT inkubieren.
- F-Aktin und Perforin färben Sie durch Zugabe von 200 μl verdünntem fluoreszenzmarkiertem Phalloidin (1 Einheit/ml markiertes Phalloidin) und fluoreszenzmarkiertem monoklonalem Anti-Perforin-Antikörper (500 ng/ml Anti-Perforin mAb). 1 Stunde bei RT inkubieren.
- Waschen Sie mit 3 ml PBS. Die Kammer ist bereit für die Bildgebung.
>5. Bildgebung der NK-Synapse auf einer Lipid-Doppelschicht mit STED
- Schalten Sie alle erforderlichen Hardwaremodule ein.
- Starten Sie die Bildanalysesoftware. Aktivieren Sie sowohl resonante Abtast- als auch STED-Module. Nachdem Sie diese Auswahl getroffen haben, warten Sie etwa 3-5 Minuten, bis die Software gestartet wird.
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Konfiguration" am oberen Bildschirmrand.
- Wählen Sie "Laser Config" und schalten Sie dann das Weißlicht und die STED 592 nm Laser ein.
- Wählen Sie das 100-fach-Objektiv und richten Sie den Anregungslaserstrahl auf den 592-nm-Verarmungslaser aus.
- Wählen Sie das Modul "Laser Config", schalten Sie den 592-Verarmungslaser aus und schalten Sie den 660-nm-Verarmungslaser ein.
- Legen Sie das Objektträger auf den Tisch über die Linse. Bringen Sie die an den abgegrenzten Doppelschichtbereich gebundenen Zellen mit der Weißlichtlampe und den Okularen in den Fokus.
- Kehren Sie zum Reiter "Erwerbung" zurück, direkt rechts neben dem Reiter "Konfiguration".
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Zu Weißlicht wechseln", schalten Sie das Modul ein und ziehen Sie die Anregungslaserlinie auf die entsprechende Wellenlänge.
- Wählen Sie den gewünschten Detektor aus der Liste der verfügbaren Detektoren aus und stellen Sie dann den Erfassungsbereich so ein, dass er den entsprechenden Wellenlängenbereich umfasst.
Anmerkung: Platzieren Sie den Erfassungsbereich NIEMALS direkt unter dem Anregungsstrahl.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Sequenziell" in der linken Symbolleiste "Erwerben", um das Dialogfeld "Sequenzielles Scannen" am unteren Rand der linken Symbolleiste aufzurufen. Auf diese Weise kann der Benutzer mehrere Sequenzen hinzufügen, jede mit einem anderen Anregungsstrahl für eine andere Farbe. Klicken Sie auf "Zwischen Frames" und stellen Sie dann die Anregungsfrequenz, den Detektor und den Erkennungsbereich für jede weitere Farbe ein, wie in den Schritten 5.9 und 5.10 beschrieben.
- Sobald alle Einstellungen optimiert sind, klicken Sie auf "Start", um den Akquisitionsprozess zu starten.