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>1. Vorbereitung von Kontrollen
- Übertragen Sie Folgendes in separate und entsprechend gekennzeichnete 1,5-ml-Röhrchen:
- Geben Sie 500 μl frisches IMDM mit resuspendierten DiO-markierten K562-Zellen in das mit "Double Positive" markierte 1,5-ml-Röhrchen.
- Geben Sie 500 μl frisches IMDM mit resuspendierten DiO-markierten K562-Zellen in das mit "DiO only" markierte 1,5-ml-Röhrchen.
- Geben Sie 500 μl frisches IMDM mit resuspendierten, unmarkierten K562-Zellen in das mit "Propidium Iodid (PI) only)" markierte 1,5-ml-Röhrchen.
- Legen Sie die doppelt positiven und PI-only-Röhrchen für 5 min in ein 55 °C heißes Wasserbad.
- Entfernen Sie nach Ablauf der 5 Minuten die Röhrchen und wischen Sie sie mit 70% Ethanol ab.
- Geben Sie 10 l PI in die doppelt positiven und nur 1,5 ml-PI-Röhrchen.
- Legen Sie alle drei K562-Zielzellensteuerungen für 30 min bei 37 °C in den Inkubator.
- Nach Ablauf der 30-minütigen Inkubation zentrifugieren Sie alle drei K562-Zielzellenkontrollen 2 Minuten lang bei 163 x g.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Küvettenpellet zu stören.
- Resuspendieren Sie jede Kontrolle mit 20 μl frischem IMDM-Zellkulturmedium und lassen Sie sie mindestens 30 Minuten lang mit 5 % CO2 im 37 °C-Inkubator, um ein optimales DiO-Signal zu erzielen.
Anmerkung: Die Kontrollen können nun durch das bildgebende Durchflusszytometer geleitet werden.
>2. Probenvorbereitung für Zytotoxizitätsassays
- Bereiten Sie 1,5-ml-Röhrchen für jede Probe/jeden Teilnehmer vor und beschriften Sie sie entsprechend.
Die - Pipette wählte das Verhältnis von NK-Zellen und DiO-markierten K562-Zellen in jedem Röhrchen.
HINWEIS: Das gewünschte Verhältnis von K562-Zielzellen und NK-Effektorzellen beträgt z. B. 1:5.
- 5 min bei 135 x g zentrifugieren.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Küvettenpellet zu stören.
- Resuspendieren Sie das NK-DiO-markierte K562-Zellgemisch in 500 μl NK-Zellmedien ohne Interleukin-2 (IL-2) und 2-Mercaptoethanol (2-ME) (unvollständiges NK-Zellkulturmedium).
HINWEIS: Bei dem unvollständigen NK-Zellkulturmedium handelt es sich um Minimum Essential Medium Eagle mit Natriumbicarbonat, ohne L-Glutamin, Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside.
- Geben Sie 5 μl PI in jedes Röhrchen.
- 2 min bei 163 x g zentrifugieren.
- Inkubieren Sie die Zellen 2 Stunden lang bei 37 °C.
- Nach 2 h Inkubation 2 min bei 163 x g zentrifugieren.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Küvettenpellet zu stören.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 25 μl unvollständigem NK-Zellkulturmedium.
>3. Vorbereitung der spontanen ("S") Probe
- Pipettieren Sie 500 μl DiO-markierte K562-Zellen (Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml) in ein 1,5-ml-Röhrchen.
- Geben Sie 10 μl PI in jedes Röhrchen.
- Zentrifugenröhrchen für 2 min bei 163 x g.
- Inkubieren Sie die Zellen 2 Stunden lang bei 37 °C.
- Nach 2 h Inkubation 2 min bei 163 x g zentrifugieren.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Küvettenpellet zu stören.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 25 μl unvollständigem Alpha-Minimum Essential Medium (α-MEM) Zellkulturmedien.
>4. Datenerfassung mit bildgebendem Durchflusszytometer
- Drücken Sie die grüne Taste in der Vordertür des bildgebenden Durchflusszytometers, um das Instrument einzuschalten.
- Schalten Sie alle Computer ein, die mit dem bildgebenden Durchflusszytometer verbunden sind.
- Starten Sie die Software für bildgebende Durchflusszytometer.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start", um das System zu spülen und die Probenleitung vorzubereiten.
- Sobald der "Start" abgeschlossen ist, schließen Sie das Fenster "Kalibrierungen".
- Kanäle zuweisen: Klicken Sie oben links auf jeden Kanal, um ihn zuzuweisen.
- Klicken Sie auf der rechten Seite auf die Schaltfläche Streudiagramm, um 4 Streudiagramme zu erstellen: Raw Max Pixel _MC_6 gegen Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 gegen Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 gegen Area_M05 und FieldArea_M01 gegen AspectRatio_M01.
- Beginnen Sie mit der Analyse von Proben, indem Sie zunächst die Kontrolle "Doppelt positiv" verwenden.
- Klicken Sie auf "Laden".
- Das 1,5-ml-Röhrchen mit der "doppelt positiven" Probe aus den Schritten 1.4 bis 1.8 wird in den Probenlader gegeben.
- Wählen Sie das 40X-Objektiv unter der Registerkarte "Vergrößerung" aus.
- Schalten Sie die Laser mit 405 mW und 642 mW ein.
- Schalten Sie den Kanal "Hellfeld" ein.
- Klicken Sie auf "Intensität auswählen".
- Bestimmen Sie anhand der "Double Positive"-Kontrollprobe die gewünschte Intensität für den 405-mW-Laser, damit der Detektor nicht überlastet wird.
Anmerkung: Zum Beispiel wurde die optimale Intensität für dieses Experiment auf 11 mW eingestellt.
- Nachdem die gewünschte Einrichtung erreicht ist, erfassen Sie Daten.
- Geben Sie auf der Registerkarte "Dateierwerb" einen benutzerdefinierten Dateinamenstext ein. Wählen Sie einen Ordner zum Speichern der Datendatei(en) aus.
- Geben Sie die Anzahl der zu erwerbenden Zellen neben "Sammeln" ein. In der Regel variiert diese Zahl zwischen 1.000 und 10.000.
- Klicken Sie auf "Erwerben"
HINWEIS: Sobald die gewünschte Anzahl von Zellen erfasst wurde, wird die Datendatei automatisch im zuvor ausgewählten Ordner gespeichert.
- Laden Sie nach Abschluss der Erfassung das nächste Kontrollsample – nur DiO-Steuerung.
- Klicken Sie auf "Laden".
- Legen Sie das 1,5-ml-Röhrchen mit der "DiO-only"-Probe in den Probenlader.
- Lassen Sie das 40X-Objektiv auf der Registerkarte "Vergrößerung" ausgewählt.
- Lassen Sie den 405-mW-Laser eingeschaltet.
- Schalten Sie den 642-mW-Laser und den "Hellfeld"-Kanal aus.
HINWEIS: Nachdem die gewünschte Einrichtung erreicht wurde, können Daten abgerufen werden.
- Geben Sie auf der Registerkarte "Dateierfassung" einen benutzerdefinierten Dateinamenstext ein und wählen Sie einen Ordner zum Speichern der Datendatei(en) aus. Geben Sie die Anzahl der zu erwerbenden Zellen neben "Sammeln" ein. In der Regel ist diese Zahl 1.000.
- Klicken Sie auf "Erwerben"
Anmerkung: Sobald die gewünschte Anzahl von Zellen erreicht ist, wird die Datendatei automatisch im zuvor ausgewählten Ordner gespeichert.
- Wiederholen Sie Schritt 4.10 für die Kontrollprobe "nur PI". Die experimentellen Proben stehen nun zur Entnahme bereit.
- Die verbleibenden experimentellen Proben, einschließlich der "spontanen 'S'-Proben", werden wie folgt behandelt:
- Lassen Sie das 40X-Objektiv auf der Registerkarte "Vergrößerung" ausgewählt.
- Schalten Sie die Laser mit 405 mW und 642 mW ein.
- Schalten Sie den Kanal "Hellfeld" ein.
- Klicken Sie auf "Intensität einstellen".
- Geben Sie auf der Registerkarte "Dateierfassung" einen benutzerdefinierten Dateinamenstext ein und wählen Sie einen Ordner zum Speichern der Datendatei(en) aus. Geben Sie einen benutzerdefinierten Dateinamen ein.
- Geben Sie die Anzahl der zu erwerbenden Zellen neben "Sammeln" ein.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Erwerben".
Anmerkung: Sobald die gewünschte Anzahl von Zellen erreicht ist, wird die Datendatei automatisch im zuvor ausgewählten Ordner gespeichert.
- Schritt 4.12 ist für alle Versuchsproben zu wiederholen.
- Nachdem alle experimentellen Daten und Dateien gesammelt wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche "Herunterfahren", um das System zu sterilisieren.
>5. Bildgebende Durchflusszytometer-Probenanalyse
- Öffnen Sie die Softwareanwendung für die Analyse des bildgebenden Durchflusszytometers.
- Öffnen Sie unter "Datei" ein experimentelles. RIF-Datei.
- Erstellen Sie eine neue Matrix mit einer einzigen Farbe. RIF-Dateien (Nur-DiO-Steuerung und Nur-PI-Steuerung, die in den Schritten 4.10 und 4.11 erstellt wurden), indem Sie in der Software für bildgebende Durchflusszytometer auf der Registerkarte Kompensation die Option "Neue Matrix erstellen" auswählen.
HINWEIS: Die Software fordert Sie auf, die einzelnen Farbdateien auszuwählen und sie zusammenzuführen, um eine Matrixdatei (Dateierweiterung .ctm) zu erstellen, die ausgewählt werden soll, um die Kanalkompensation anzuwenden.
- Erstellen Sie Punktdiagramme mit der Funktion "Bausteine" der Software.
- Erstellen Sie ein Punktdiagramm (BrightFieldGradient_RMS vs. Häufigkeit), um die fokussierten Zellen zu begrenzen. Nennen Sie das Gate "Focus" (Abbildung 1A).
- Erstellen Sie mit dem "Fokus"-Gate ein Punktdiagramm des Hellfeldbereichs im Vergleich zum Hellfeld-Seitenverhältnis, um die Singulett-Zellen zu gaten. Nennen Sie das Gate "Single" (Abbildung 1B).
- Erstellen Sie mit dem "Single"-Gate ein Punktdiagramm von Intensity_MC_Ch02 und Intensity_MC_Ch5. Verwenden Sie dieses Diagramm, um nur DiO-positive Zellen (Targets, lebendig) und PI-DiO-Double-Positive-Zellen (Targets, tot) zu identifizieren und zu gaten (Abbildung 1C).
Anmerkung: Alle in den Schritten 5.4.1, 5.4.2 und 5.4.3 beschriebenen Diagramme können mit der Funktion "Bausteine" der Software erstellt werden.
- Klicken Sie auf die Statistikfunktion des Punktdiagramms, um auf die Zellennummern der einzelnen Gatter zuzugreifen.
- Berechnen Sie den Prozentsatz der toten Ziele in der spontanen Stichprobe und in den experimentellen Proben mit der folgenden Formel:
% tote Ziele in der Stichprobe = (#dead Ziele x 100)/(#live Ziele + #dead Ziele)
- Berechnen Sie die Zytotoxizität mit der folgenden Formel:
% Zytotoxizität = [(Experimentell tot-Spontan tot)/(100-Spontan tot)]x100
