Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Allgemeine Vorbereitung von PCLS beim Menschen und anschließende Exposition gegenüber Chemikalien
HINWEIS: Zwei Personen werden benötigt, um eine Lunge zu füllen. Ein aktueller Impfpass für Hepatitis A und B wird empfohlen. Die Patienten werden vor einer Lungentransplantation routinemäßig auf HCV und HIV untersucht. Wird eine aktive Infektion mit Mycobacterium tuberculosis diagnostiziert oder vermutet, sollte die Lunge abgestoßen werden. Dennoch müssen sämtliches frisches menschliches Lungengewebe und daraus gewonnene Proben als potenziell infektiös behandelt und entsprechende Schutzmaßnahmen (Partikelfiltermasken (FFP2), Schutzbrille, Handschuhe) getroffen werden, um die Arbeitssicherheit des Personals zu gewährleisten. Der Eingriff dauert 60 - 90 Minuten.
- Bestätigen Sie die Unversehrtheit des menschlichen Lungenlappens.
Anmerkung: Ein Riss im Brustfell verhindert eine homogene Füllung des Gewebes. Menschliches Lungenmaterial muss ab dem Tag der Resektion vorliegen. Lagerzeiten von ca. 2 h bei Raumtemperatur (RT) vor dem Befüllen mit Agarose auf Eis werden toleriert. Das Gewebe, das wir in diesem Protokoll verwenden, stammt von Patienten, die sich einer Resektion unterziehen. Es stammt nicht von verstorbenen Patienten. Wenn das Gewebe auf Eis gelagert wurde, erwärmen Sie es vor dem Befüllen auf RT, da sonst die Agarose sofort polymerisiert und keine homogene Füllung möglich ist.
Vorsicht: Stellen Sie sicher, dass alle Personen, die mit einheimischem menschlichem Material in Berührung kommen, Schutzkleidung anziehen, die aus einem Laborkittel, zwei Paar Handschuhen, einer Mütze, einer Gesichtsmaske und einer Schutzbrille besteht. Menschliches Material ist potenziell infektiös.
- Wiegen Sie 7,5 g niedrig gelierende Agarose ab und geben Sie sie in 250 mL bi-destilliertes Wasser. Kochen Sie die Agarose in der Mikrowelle, bis sich die Agarose aufgelöst hat. Kühlen Sie es auf ca. 40 °C ab, abhängig vom Schmelz- und Gelierpunkt der Agarose.
Anmerkung: Je nach Keulengröße werden mehrere Kolben benötigt.
- Das Nährmedium (Materialtabelle) vorwärmen und bei 37 °C halten.
Anmerkung: Wenn die Agarose zu heiß ist, verlieren die Vitamine im Nährmedium ihre Wirksamkeit und die Zellen werden geschädigt. Wenn die Temperatur des Mediums/der Agaroselösung unter 37 °C liegt, beginnt der Gelierprozess und beeinträchtigt die homogene Füllung der Lunge. Es wird nur ein Temperaturbereich von 37 °C bis 39 °C empfohlen.
- Legen Sie vor dem Start alle benötigten Materialien in Reichweite: 5 - 10 Klemmen, einen flexiblen Katheter von ca. 1 m Länge, eine geeignete Spritze (z. B. 50 mL), die den Anschluss an den Katheter bildet, und eine mit Eis gefüllte Eisbox.
- Kanülieren Sie die Luftröhre/den Hauptbronchus, indem Sie den Silikonschlauch einführen und ihn mit einer parallel zum Schlauch ausgerichteten Klemme fixieren, so dass die Klemme das Gewebe neben dem Silikonschlauch zusammendrückt, ohne ihn abzuklemmen. Vergewissern Sie sich, dass der Silikonschlauch innen fixiert ist und während des Füllvorgangs nicht herausrutschen kann. Alle anderen Bronchien, Blutgefäße und Verletzungen mit Klammern verschließen, damit während des Füllvorgangs keine Agarose austreten kann.
- Mischen Sie ein äquivalentes Volumen von 3 % schwach gelierender Agarose mit Kulturmedium in einem Becherglas. Träufeln Sie die Mischung mit einer 50-ml-Spritze in die Lunge. Bevor Sie die Spritze wieder mit Medium befüllen, klemmen Sie den Katheter mit den Fingern oder einer Klemme zu, um Luftblasen und Agarose-Reflux zu vermeiden. Füllen Sie den Lungenlappen, bis er vollständig aufgeblasen ist. Berühren Sie vorsichtig das Lungenfellfell an der Seite; Das Brustfell sollte eben und hart sein.
Anmerkung: Je nach Größe des Lungenlappens können bis zu 2 oder 3 l Agarose/mittlere Lösung erforderlich sein.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,5 - 1,6 für jeden Bronchus bei mehreren Bronchien innerhalb einer Probe.
- Legen Sie die Lunge für die Polymerisation der Agarose auf Eis für 20 - 40 min, abhängig von der Menge der eingeflößten Agarose. Berühren Sie die Pleura vorsichtig von mehreren Seiten, um zu prüfen, ob sie hart und kühl ist, was darauf hinweist, dass die Polymerisation abgeschlossen ist, andernfalls warten Sie weiter. Lassen Sie die Pathologen die Lunge in Scheiben schneiden, ihre Proben entnehmen und das Lungenmaterial für den Transport auf Eis lagern.
- Schneiden Sie das menschliche Lungengewebe mit einem scharfen Messer in 3 - 5 cm große Platten.
Anmerkung: Verwenden Sie für jede Lunge eine neue Klinge, um die Schärfe zu gewährleisten.
- Füllen Sie den Tissue-Slicer mit 400 mL eiskalter Earle's Balanced Salt Solution (EBSS). Schneiden Sie sofort zylindrische Gewebekerne mit einem halbautomatischen Schraubendreher mit einem Entkernungswerkzeug des gewünschten Durchmessers (z. B. 8 mm; 10 mm) aus den Lungenplatten heraus.
Anmerkung: Dieser Durchmesser muss dem Durchmesser des Taschentuchhalters im Inneren der Maschine entsprechen.
- Stellen Sie die Dicke der Lungenscheiben auf den gewünschten Dickenwert ein.
Anmerkung: Eine Dicke von ca. 250 μm wird üblicherweise in PCLS-Experimenten verwendet. Der Hersteller des Tissue-Slicers empfiehlt sein Tissue Slice Thickness Gauge zur Überprüfung der Scheibendicke. Alternativ kann die Whole-Mount-Färbung in Kombination mit der konfokalen Mikroskopie verwendet werden, um die Schichtdicke zu bestimmen.
- Übertragen Sie die Gewebekerne in den Gewebehalter des Tissue Slicers. Legen Sie das Gewicht (einen Teil des Gewebehalters) auf den Gewebekern. Stellen Sie die Armgeschwindigkeit und die Klingengeschwindigkeit am Tissue Slicer auf 6 ein. Beginnen Sie mit dem Schneiden des Gewebekerns in PCLS.
- Ergänzen Sie 500 mL handelsübliches Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): Nährstoffmischung F-12 DMEM/F12 (1:1) mit 5 mL Penicillin (10.000 Einheiten/ml) und Streptomycin (10.000 μg/ml). Lagern Sie das Nährmedium mehrere Tage lang unter sterilen Bedingungen im Kühlschrank. Nur das benötigte Volumen des Mediums vorwärmen.
Anmerkung: Penicillin wird inaktiviert, wenn es über einen längeren Zeitraum bei 37 °C gehalten wird. Verwenden Sie serum- und farbstofffreies Kulturmedium, da die Serumzusammensetzung von Charge zu Charge variiert und Farbstoffe wie Phenolrot die Assays beeinträchtigen können.
- Füllen Sie eine Petrischale (100 x 15 mm) mit 25 mL eiskaltem Nährmedium. Das Medium sollte aus dem Allesschneider in ein Becherglas abgelassen werden, indem die Klemme des Glaszylinders geöffnet wird. Übertragen Sie die Scheiben aus einem Becherglas mit Hilfe eines Applikators (z. B. Impfschlaufe) in die Petrischale mit Nährmedium. Stellen Sie die Petrischale in einen Inkubator (37 °C, 5 % CO2, 100 % Luftfeuchtigkeit). Lassen Sie das Medium erwärmen, bevor Sie mit dem Waschen beginnen.
Anmerkung: Alle weiteren Schritte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
- Geben Sie ein Zellsieb in die Petrischale, um das PCLS zu waschen. Entfernen Sie das Nährmedium vollständig mit einer serologischen 10-ml-Pipette durch das Zellsieb und fügen Sie 25 mL vorgewärmtes frisches Medium mit 37 °C hinzu. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 - 4 Mal alle 30 Min.
Anmerkung: Das Zellsieb verhindert, dass die Scheiben in die Pipette gesaugt werden, um eine Beschädigung der Scheiben zu vermeiden.
- Übertragen Sie die Lungenscheiben vorsichtig in eine 24-Well-Kulturplatte mit mindestens 500 μl Kulturmedium für zwei Scheiben pro Well.
Anmerkung: Verwenden Sie für den Transfer vorzugsweise eine Impfschlaufe und lassen Sie die Scheiben auf der Schlaufe schwimmen, um Gewebeschäden zu vermeiden. Eine weitere Trennung der Scheiben ist nicht erforderlich, da nur ein Mangel an ausreichend frischem Medium den Zelltod in Gewebeschnitten induziert. Die Scheiben können sich in der Vertiefung überlappen oder berühren: Dies hat keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit des Gewebes.
