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Alle Verfahren, bei denen Proben entnommen werden, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt
>1. Allgemeine Vorbereitung von PCLS beim Menschen und anschließende Exposition gegenüber Chemikalien
HINWEIS: Zwei Personen werden benötigt, um eine Lunge zu füllen. Ein aktueller Impfpass für Hepatitis A und B wird empfohlen. Die Patienten werden vor einer Lungentransplantation routinemäßig auf HCV und HIV untersucht. Wird eine aktive Infektion mit Mycobacterium tuberculosis diagnostiziert oder vermutet, sollte die Lunge abgestoßen werden. Dennoch müssen sämtliches frisches menschliches Lungengewebe und daraus gewonnene Proben als potenziell infektiös behandelt und entsprechende Schutzmaßnahmen (Partikelfiltermasken (FFP2), Schutzbrille, Handschuhe) getroffen werden, um die Arbeitssicherheit des Personals zu gewährleisten. Der Eingriff dauert 60 - 90 Minuten.
- Bestätigen Sie die Unversehrtheit des menschlichen Lungenlappens.
Anmerkung: Ein Riss im Brustfell verhindert eine homogene Füllung des Gewebes. Menschliches Lungenmaterial muss ab dem Tag der Resektion vorliegen. Lagerzeiten von ca. 2 h bei Raumtemperatur (RT) vor dem Befüllen mit Agarose auf Eis werden toleriert. Das Gewebe, das wir in diesem Protokoll verwenden, stammt von Patienten, die sich einer Resektion unterziehen. Es stammt nicht von verstorbenen Patienten. Wenn das Gewebe auf Eis gelagert wurde, erwärmen Sie es vor dem Befüllen auf RT, da sonst die Agarose sofort polymerisiert und keine homogene Füllung möglich ist.
Vorsicht: Stellen Sie sicher, dass alle Personen, die mit einheimischem menschlichem Material in Berührung kommen, Schutzkleidung anziehen, die aus einem Laborkittel, zwei Paar Handschuhen, einer Mütze, einer Gesichtsmaske und einer Schutzbrille besteht. Menschliches Material ist potenziell infektiös.
- Wiegen Sie 7,5 g niedrig gelierende Agarose ab und geben Sie sie in 250 mL bi-destilliertes Wasser. Kochen Sie die Agarose in der Mikrowelle, bis sich die Agarose aufgelöst hat. Kühlen Sie es auf ca. 40 °C ab, abhängig vom Schmelz- und Gelierpunkt der Agarose.
Anmerkung: Je nach Keulengröße werden mehrere Kolben benötigt.
- Das Nährmedium (Materialtabelle) vorwärmen und bei 37 °C halten.
Anmerkung: Wenn die Agarose zu heiß ist, verlieren die Vitamine im Nährmedium ihre Wirksamkeit und die Zellen werden geschädigt. Wenn die Temperatur des Mediums/der Agaroselösung unter 37 °C liegt, beginnt der Gelierprozess und beeinträchtigt die homogene Füllung der Lunge. Es wird nur ein Temperaturbereich von 37 °C bis 39 °C empfohlen.
- Legen Sie vor dem Start alle benötigten Materialien in Reichweite: 5 - 10 Klemmen, einen flexiblen Katheter von ca. 1 m Länge, eine geeignete Spritze (z. B. 50 mL), die den Anschluss an den Katheter bildet, und eine mit Eis gefüllte Eisbox.
- Kanülieren Sie die Luftröhre/den Hauptbronchus, indem Sie den Silikonschlauch einführen und ihn mit einer parallel zum Schlauch ausgerichteten Klemme fixieren, so dass die Klemme das Gewebe neben dem Silikonschlauch zusammendrückt, ohne ihn abzuklemmen. Vergewissern Sie sich, dass der Silikonschlauch innen fixiert ist und während des Füllvorgangs nicht herausrutschen kann. Alle anderen Bronchien, Blutgefäße und Verletzungen mit Klammern verschließen, damit während des Füllvorgangs keine Agarose austreten kann.
- Mischen Sie ein äquivalentes Volumen von 3 % schwach gelierender Agarose mit Kulturmedium in einem Becherglas. Träufeln Sie die Mischung mit einer 50-ml-Spritze in die Lunge. Bevor Sie die Spritze wieder mit Medium befüllen, klemmen Sie den Katheter mit den Fingern oder einer Klemme zu, um Luftblasen und Agarose-Reflux zu vermeiden. Füllen Sie den Lungenlappen, bis er vollständig aufgeblasen ist. Berühren Sie vorsichtig das Lungenfellfell an der Seite; Das Brustfell sollte eben und hart sein.
Anmerkung: Je nach Größe des Lungenlappens können bis zu 2 oder 3 l Agarose/mittlere Lösung erforderlich sein.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,5 - 1,6 für jeden Bronchus bei mehreren Bronchien innerhalb einer Probe.
- Legen Sie die Lunge für die Polymerisation der Agarose auf Eis für 20 - 40 min, abhängig von der Menge der eingeflößten Agarose. Berühren Sie die Pleura vorsichtig von mehreren Seiten, um zu prüfen, ob sie hart und kühl ist, was darauf hinweist, dass die Polymerisation abgeschlossen ist, andernfalls warten Sie weiter. Die Pathologen schneiden die Lunge in Scheiben, entnehmen ihre Proben und lagern das Lungenmaterial für den Transport auf Eis.
- Schneiden Sie das menschliche Lungengewebe mit einem scharfen Messer in 3 - 5 cm große Platten.
Anmerkung: Verwenden Sie für jede Lunge eine neue Klinge, um die Schärfe zu gewährleisten.
- Füllen Sie den Tissue-Slicer mit 400 mL eiskalter Earle's Balanced Salt Solution (EBSS). Schneiden Sie sofort zylindrische Gewebekerne mit einem halbautomatischen Schraubendreher mit einem Entkernungswerkzeug des gewünschten Durchmessers (z. B. 8 mm; 10 mm) aus den Lungenplatten heraus.
HINWEIS: Dieser Durchmesser muss dem Durchmesser des Taschentuchhalters im Inneren des Geräts entsprechen.
- Stellen Sie die Dicke der Lungenscheiben auf den gewünschten Dickenwert ein.
Anmerkung: Eine Dicke von ca. 250 μm wird üblicherweise in PCLS-Experimenten verwendet. Der Hersteller des Tissue-Slicers empfiehlt sein Tissue Slice Thickness Gauge zur Überprüfung der Scheibendicke. Alternativ kann die Whole-Mount-Färbung in Kombination mit konfokaler Mikroskopie verwendet werden, um die Schichtdicke zu bestimmen, wie von Brismar et al. beschrieben.27
- Übertragen Sie die Gewebekerne in den Gewebehalter des Tissue Slicers. Legen Sie das Gewicht (einen Teil des Gewebehalters) auf den Gewebekern. Stellen Sie die Armgeschwindigkeit und die Klingengeschwindigkeit am Tissue Slicer auf 6 ein. Beginnen Sie mit dem Schneiden des Gewebekerns in PCLS.
- Ergänzen Sie 500 mL handelsübliches Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): Nährstoffmischung F-12 DMEM/F12 (1:1) mit 5 mL Penicillin (10.000 Einheiten/ml) und Streptomycin (10.000 μg/ml). Lagern Sie das Nährmedium mehrere Tage lang unter sterilen Bedingungen im Kühlschrank. Nur das benötigte Volumen des Mediums vorwärmen.
Anmerkung: Penicillin wird inaktiviert, wenn es über einen längeren Zeitraum bei 37 °C gehalten wird. Verwenden Sie serum- und farbstofffreies Kulturmedium, da die Serumzusammensetzung von Charge zu Charge variiert und Farbstoffe wie Phenolrot die Assays beeinträchtigen können.
- Füllen Sie eine Petrischale (100 x 15 mm) mit 25 mL eiskaltem Nährmedium. Das Medium sollte aus dem Allesschneider in ein Becherglas abgelassen werden, indem die Klemme des Glaszylinders geöffnet wird. Übertragen Sie die Scheiben aus einem Becherglas mit Hilfe eines Applikators (z. B. Impfschlaufe) in die Petrischale mit Nährmedium. Stellen Sie die Petrischale in einen Inkubator (37 °C, 5 % CO2, 100 % Luftfeuchtigkeit). Lassen Sie das Medium erwärmen, bevor Sie mit dem Waschen beginnen.
Anmerkung: Alle weiteren Schritte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
- Geben Sie ein Zellsieb in die Petrischale, um das PCLS zu waschen. Entfernen Sie das Nährmedium vollständig mit einer serologischen 10-ml-Pipette durch das Zellsieb und fügen Sie 25 mL vorgewärmtes frisches Medium mit 37 °C hinzu. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 - 4 Mal alle 30 Min.
Anmerkung: Das Zellsieb verhindert, dass die Scheiben in die Pipette gesaugt werden, um eine Beschädigung der Scheiben zu vermeiden.
- Übertragen Sie die Lungenscheiben vorsichtig in eine 24-Well-Kulturplatte mit mindestens 500 μl Kulturmedium für zwei Scheiben pro Well. Das Lungengewebe Substanzen aussetzen (siehe Schritte 3.1 - 3.4), z.B. für 24 h bei 37 °C, 5 % CO2,< />
Anmerkung: Verwenden Sie für den Transfer vorzugsweise eine Impfschlaufe und lassen Sie die Scheiben auf der Schlaufe schwimmen, um Gewebeschäden zu vermeiden. Eine weitere Trennung der Scheiben ist nicht erforderlich, da nur ein Mangel an ausreichend frischem Medium den Zelltod in Gewebeschnitten induziert. Die Scheiben können sich in der Vertiefung überlappen oder berühren: Dies hat keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit des Gewebes.
- Alle menschlichen Reststoffe werden für mindestens 24 Stunden in einen Kunststoffkolben mit einem Fixiermittel (z.B. 10% gepuffertes Formaldehyd) gegeben und im Entsorgungsprozess verbrannt.
Achtung: Formaldehyd ist giftig, führen Sie diesen Schritt unter einer Haube durch.
>2. Herstellung von Lösungen für Stoffe
HINWEIS: Bereiten Sie sofort vor der Verwendung funktionierende Lösungen und Kontrollen vor.
Vorsicht: Behandeln Sie Substanzen gemäß den Sicherheitsanweisungen oder, falls unbekannt, als potenziell schädlich und befolgen Sie die routinemäßigen Sicherheitsvorkehrungen.
- Wasserlösliche Substanzen direkt im Nährmedium auflösen. Bei unlöslichen oder schwer löslichen Chemikalien lösen Sie die Substanz je nach Löslichkeit der Substanz zunächst in den entsprechenden Lösungsmitteln. Substanzen mit begrenzter Wasserlöslichkeit (<0,1 mg/ml) können z. B. in DMSO oder Ethanol gelöst werden. Die Konzentrationen ungiftiger Lösungsmittel sollten zuvor durch Titration bestimmt werden. Es ist darauf zu achten, dass die Substanzen bei der Einfettung in das Medium nicht aus der Lösung ausscheiden.
Anmerkung: HClPt und Natriumlaurethsulfat (SLS)-Lösungen werden hergestellt.
- Bereiten Sie Stoffstammlösungen mit dem 100-fachen der gewünschten höchsten Konzentration im Kulturmedium oder Lösungsmittel vor. 12,5 mg HClPt und 34,4 mg SLS werden gewogen und Stammlösungen hergestellt, indem die Chemikalien in 1 mL Nährmedium aufgelöst werden.
Anmerkung: Für diese Chemikalien wird kein Lösungsmittel benötigt.
- Bereiten Sie eine abschließende Verdünnung von 1:100 in einem vorgewärmten Medium vor. Bei der Vorverwendung von Lösungsmitteln führt dieser Ansatz zu der gleichen Lösungsmittelendkonzentration für alle Stoffkonzentrationen.
- Verwenden Sie die endgültige Lösungsmittelkonzentration (z. B. 1 %, wie in Schritt 2.3 beschrieben) für die Referenzbehandlung von PCLS. Für die im Ergebnisteil genannten Chemikalien war keine Lösungsmittelkontrolle erforderlich.
>3. Positive und negative Referenzen für Zytotoxizitätsassays
- Für alle Viabilitätstests sind die folgenden Positiv- und Negativkontrollen zu erstellen:
- Gewebekontrolle: Inkubieren Sie PCLS in einem Kulturmedium nur als Referenz für unbehandelte PCLS für 24 Stunden unter Zellkulturbedingungen (37 °C, 5 % CO2, 100 % Luftfeuchtigkeit).
- Vehikelkontrolle (falls erforderlich): Inkubieren Sie PCLS mit der endgültigen Lösungsmittelkonzentration als Referenz für PCLS, die nur mit Vehikel behandelt wurden (siehe Schritt 1.4), für 24 Stunden unter Zellkulturbedingungen (37 °C, 5 % CO2, 100 % Luftfeuchtigkeit).
- Positivkontrolle: PCLS mit 1%igem Detergens in Pufferlösung für 1 h bei 4 °C inkubieren.
Anmerkung: Wenn PCLS farblos wird, ist das Gewebe tot. Die Gesamt-L-Lactat-Dehydrogenase (LDH) wird im Überstand bestimmt, mit einer Resorption von etwa 1,9 - 2,3 (siehe Schritte 4.1 - 4.4).
>4. LDH-Assay
Hinweis: Der LDH-Assay wird in einer 96-Well-Platte mit insgesamt 100 μl Kulturüberstand nach der Nachinkubationszeit durchgeführt.
- Nach der Inkubation des PCLS mit oder ohne die Testmittel werden 50 μl Überstand aus Schritt 1.16 entnommen und in Duplikaten in eine neue 96-Well-Platte überführt. Dadurch werden Duplikate aus jeder behandelten Vertiefung einer 24-Well-Platte erzeugt.
- Bereiten Sie die Arbeitslösung des LDH-Reagenzes unmittelbar vor dem Assay vor. Die Arbeitslösung besteht aus der Katalysatorlösung (Lyophilisat, gelöst in 1 mL bidstilliertem Wasser) und der vom Hersteller gelieferten Farbstofflösung. Für eine 96-Well-Platte werden 125 μl Katalysatorlösung gründlich mit 6,25 ml Farbstofflösung gemischt.
Vorsicht: Setzen Sie die Lösung nicht direktem Licht aus.
- 50 μl der Arbeitslösung werden in jede Vertiefung pipetiert, die bereits 50 μl Überstand enthält, und die Platte wird 20 Minuten lang bei RT im Dunkeln inkubiert. Es ist kein weiteres Mischen erforderlich.
- Messen Sie die Absorption jeder Vertiefung bei 492 nm (Referenz: 630 nm) mit einem Mikroplatten-Reader. Subtrahieren Sie die Absorption bei 630 nm von 492 nm. Diese Werte werden für die Berechnung in Schritt 3.5.
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Anmerkung: Zuverlässige Daten für die Beurteilung der Zytotoxizität können nur aus lebensfähigem Gewebe gewonnen werden. Die Resorption der mit Detergenzien behandelten Kontrolle sollte über 1 liegen.
- Für die Analyse wird der Absorptionswert der Positivkontrolle aus Schritt 2.1 auf 100 % festgelegt und die LDH-Freisetzung in behandelten Proben im Verhältnis zur Positivkontrolle (d. h. maximale LDH-Freisetzung) berechnet.