Ein fluoreszenzbasierter Assay mit gentechnisch veränderten Lymphozyten zum Screening immunmodulatorischer Verbindungen

Abstract

Quelle: Fouda, A., et al., Ein fluoreszenzbasierter Lymphozyten-Assay, der für das Hochdurchsatz-Screening kleiner Moleküle geeignet ist. J. Vis. Exp., (2017).

Dieses Video zeigt das Screening von immunmodulatorischen Verbindungen mittels fluoreszenzbasiertem Assay. Transgene T-Lymphozyten aus der Maus mit grün fluoreszierenden Proteinexpressionskassetten werden mit diesen Verbindungen behandelt. Die verstärkten und reduzierten GFP-Signale ermöglichen die Identifizierung der stimulierenden bzw. hemmenden Wirkungen der Verbindungen.

Protocol

>1. Herstellung von Splenozytenmedium und Durchflusszytometrie-Puffer

1. Führen Sie alle Schritte unter einer zu 70 % mit Ethanol gereinigten biologischen Haube durch.
2. Entnehmen Sie 70 ml vorgewärmtes Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x Medium (im Handel erhältlich und in sterilen Flaschen mit einem Volumen von 500 ml geliefert) und geben Sie es in ein steriles Röhrchen. Das entfernte Medium wird später im Protokoll verwendet.
3. Ergänzen Sie die restlichen 430 ml RPMI 1640 1x mit 50 ml inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 5 ml Penicillin/Streptomycin, 5 ml N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure (HEPES),....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nur77GFP-Mäuse	Das Jackson-Labor	Maus-Stamm Nr. 016617	In unserer Tierhaltung wurde eine hauseigene Kolonie gegründet
96 Wells-U Kulturplatten, steril	VWR Deutschland	Tel.: 10062-902	T-Zell-Aktivierung mit den magnetischen Kügelchen
70μm Zellsieb, steril	Corning Inc.	Artikel-Nr.: 352350	Erzeugung von Splenozyten-Zellsuspension
5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen, steril	Corning Inc.	352058	Erzeugung von Splenozyten-Zellsuspension
50 ml Röhrchen aus Polypropylen mit konischem Boden, steril	VWR Deutschland	Artikel-Nr.: 89039-656	Erzeugung von Splenozyten-Zellsuspension
10 ml Spritze ohne Nadel, steril	Becton, Dickinson und Co.	305482	Um die Milz zu zerdrücken
5 ml Zellkulturschale, steril	Greiner Bio-One	627 160	Um die Milz zu zerdrücken
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	WISENT Inc.	450-200-EL	Bestandteil des Splenozytenmediums
RPMI 1600 mit Natriumbicarbonat und L-Glutamin	WISENT Inc.	350-002-CL	Bestandteil des Splenozytenmediums
MEM-nicht-essentielle Aminosäuren	WISENT Inc.	321-010-EL	Bestandteil des Splenozytenmediums
HEPES freie Säure 1 M	WISENT Inc.	Artikel-Nr.: 330-050-EL	Bestandteil des Splenozytenmediums
Natriumpyruvat-Lösung (100mM)	WISENT Inc.	600-110-EL	Bestandteil des Splenozytenmediums
Fötales Rinderserum (FBS)	WISENT Inc.	Tel.: 080-910	Bestandteil des Splenozytenmediums und des Durchflusszytometrie-Puffers
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	WISENT Inc.	311-010-CL	Bestandteil des Durchflusszytometrie-Puffers
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 21985-023	Bestandteil des Splenozytenmediums
T-Zellen Isolationskit	Stammzellen-Technologien	19851	So isolieren Sie T-Zellen
Maus T-Aktivator CD3/CD28 superparamagnetische Kügelchen	Thermo Fisher Scientific	11452D	So aktivieren Sie T-Zellen
Magnet zur Isolierung von Zellen	Stammzellen-Technologien	Nr. 18000	Um T-Zellen zu isolieren und die magnetischen Kügelchen zu entfernen
Rekombinante Maus IL-7	Peprotech	Nr. 217-17	Zur Unterstützung des Überlebens der T-Zellen während der Aktivierung
Anti-Maus-CD3-Antikörper	BD Pharmingen	561799	Zur Färbung von T-Zellen für die Durchflusszytometrie
Biomed FXp	PerkinElmer Inc.	Nr. A31842	Zur Resuspendierung von Zellen nach 24 Stunden Inkubation
Opera Phenix High-Content-Screening-System	PerkinElmer Inc.	HH14000000	Zur Analyse des GFP/Hoechst-Signals