Ein fluoreszenzbasierter Assay mit gentechnisch veränderten Lymphozyten zum Screening immunmodulatorischer Verbindungen

Abstract

Quelle: Fouda, A., et al., Ein fluoreszenzbasierter Lymphozyten-Assay, der für das Hochdurchsatz-Screening kleiner Moleküle geeignet ist. J. Vis. Exp., (2017).

Dieses Video zeigt das Screening von immunmodulatorischen Verbindungen mittels fluoreszenzbasiertem Assay. Transgene T-Lymphozyten aus der Maus mit grün fluoreszierenden Proteinexpressionskassetten werden mit diesen Verbindungen behandelt. Die verstärkten und reduzierten GFP-Signale ermöglichen die Identifizierung der stimulierenden bzw. hemmenden Wirkungen der Verbindungen.

Protocol

>1. Herstellung von Splenozytenmedium und Durchflusszytometrie-Puffer

1. Führen Sie alle Schritte unter einer zu 70 % mit Ethanol gereinigten biologischen Haube durch.
2. Entnehmen Sie 70 ml vorgewärmtes Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x Medium (im Handel erhältlich und in sterilen Flaschen mit einem Volumen von 500 ml geliefert) und geben Sie es in ein steriles Röhrchen. Das entfernte Medium wird später im Protokoll verwendet.
3. Ergänzen Sie die restlichen 430 ml RPMI 1640 1x mit 50 ml inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 5 ml Penicillin/Streptomycin, 5 ml N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure (HEPES), 5 ml nicht-essentiellen Aminosäuren, 5 ml Natriumpyruvat und 0,05 ml gefiltertem (1M) 2-Mercaptoethanol.
   Anmerkung: Erwärmen Sie das Splenozytenmedium mit einem Wasserbad bei 37 ºC, um einen Hitzeschock der Zellen zu vermeiden. Dies ist wichtig, um die Induktion der zellulären Apoptose zu vermeiden.
4. Zur Herstellung des Durchflusszytometrie-Puffers 2 ml FBS zu 98 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) geben und bis zur Verwendung (vorzugsweise innerhalb von drei Tagen) im Kühlschrank aufbewahren.

>2. Erzeugung von Splenozytenzellsuspension aus Nur77^GFP Mausmilz

1. Isolieren Sie die Milz aseptisch von einer 6-8 Wochen alten weiblichen Nur77^GFP-Maus.
   1. Um dies zu erreichen, arbeiten Sie unter einer sterilen Haube. Tränken Sie das geopferte Mäusefell, die Schere und die Pinzette in 70% Ethanol.
   2. Legen Sie die Maus auf die rechte Seite und schneiden Sie die Haut und Muskeln im oberen linken Bauchquadranten auf. Untersuchen Sie den Inzisionsbereich, um die Milz sichtbar zu lokalisieren, und schneiden Sie sie dann heraus. Bewahren Sie die Milz in Splenozytenmedium auf Eis auf, bis Sie bereit sind, den nächsten Schritt auszuführen.
2. Legen Sie die Milz(en) in eine 10 cm große Petrischale mit² Zellen und 5 ml vorgewärmtem Splenozytenmedium.
3. Zerdrücke die Milz mit einem sterilen Spritzenkolben, bis die Lösung trüb ist. Am Ende des Eingriffs sollte eine Milzkollagenmatrix übrig bleiben.
4. Nach ausgiebigem Einmaischen in Splenozytenmedium sammeln Sie die Zellsuspension und leiten Sie sie durch ein 70-μm-Zellsieb, das auf einem 50-ml-Röhrchen platziert ist, um Ablagerungen oder Gerinnsel herauszufiltern.
5. Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie das Zellpellet in 2-3 ml hausgemachtem oder kommerziellem Erythrozyten-Lysepuffer erneut. Nach dem Pipettieren (2-3 mal) die Suspension 20-30 s ruhen lassen.
6. Fügen Sie 5 mL PBS oder einen geeigneten Puffer Ihrer Wahl hinzu und zentrifugieren Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 500 x g.
7. Entfernen Sie den Überstand (sollte rot sein, da er lysierte rote Blutkörperchen enthält) und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in 2 ml Splenozytenmedium.
8. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Anzahl der mit Trypanblau gefärbten Zellen, um zwischen lebenden und toten (nekrotischen) Zellen zu unterscheiden.

>3. Isolierung von T-Zellen aus der Splenozytenzellsuspension

1. Die Zellsuspension wird 5 min lang bei 500 x g zentrifugiert. Resuspendieren Sie die Zellen in serumfreiem RPMI-Medium (50 ml aus Schritt 1.3), um eine zelluläre Konzentration von 10 x 10⁶ Zellen/ml zu erhalten.
2. Übertragen Sie die Zellen in ein 5-ml-Polystyrolröhrchen und legen Sie ein 100-μl-Aliquot an Splenozyten für die Reinheitsbewertung/den Reinheitsvergleich am Ende des Reinigungsschritts beiseite.
3. Geben Sie normales Rattenserum mit 50 μl/ml in die Zellsuspension, gefolgt von einem T-Zell-Isolierungs-Antikörpercocktail (50 μl/ml).
4. Mischen Sie die Zellsuspension und lassen Sie sie 10 min ruhen. Dieser Schritt ermöglicht es dem Antikörper-Cocktail, alle unerwünschten Zellen zu binden.
5. Geben Sie die Streptavidin-Schnellkugeln (magnetische Kügelchen) für 2,5 Minuten hinzu und bringen Sie das Volumen dann mit dem serumfreien Medium auf 2,5 ml.
6. Legen Sie das Röhrchen für 3 Minuten in einen Zellisolationsmagneten.
7. Übertragen Sie die T-Zell-Suspension in ein neues Polystyrolröhrchen, indem Sie den Magneten festhalten und die Lösung in einer Bewegung ausgießen.
   Anmerkung: Die isolierte Suspension enthält die gereinigten T-Zellen. Alle unerwünschten Zellen werden an der Seite des Röhrchens gehalten und an die magnetischen Streptavidin-Kügelchen gebunden.
8. Zählen Sie die isolierten T-Zellen mit Trypanblau und einem Hämozytometer.
   Anmerkung: In diesem Schritt kann die Reinheit der isolierten T-Zellen überprüft werden (optional), indem der Prozentsatz der CD3^+-Ereignisse vor und nach der T-Zellisolierung mittels Durchflusszytometrie analysiert wird.
   1. Kurz 1 ml Splenozytenzellsuspension bei 500 x g zentrifugieren. Der Überstand wird verworfen und die Zellen in einem Durchflusszytometrie-Puffer in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml suspendiert.
   2. Fluoreszenzmarkierte Anti-Maus-CD3-Antikörper in einer Konzentration von 1:100 zugeben. 30 min bei 4 °C inkubieren. Einmal waschen, zentrifugieren und zur Analyse durch Durchflusszytometrie (400 μl) erneut in einem Durchflusszytometrie-Puffer suspendieren.

>4. T-Zell-Aktivierung und die Induktion der Expression von grün fluoreszierendem Protein (GFP)

1. Die T-Zellen werden in Suspension in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden in einer Konzentration von 2,5 x 10⁵ Zellen/Well ausgesät.
2. Fügen Sie rekombinantes Interleukin (IL)-7 in 2 ng/ml und CD3/CD28 magnetische Kügelchen (25 μl/10,⁶ Zellen) hinzu. Bewahren Sie einen Teil der T-Zellen unbehandelt mit Kügelchen auf, um als Negativkontrolle für spätere Messungen zu dienen, die nicht aktivierte T-Zellen darstellen.
3. Ernten Sie zwölf Stunden später die T-Zellen aus der 96-Well-Platte, indem Sie die Zellsuspension in jeder Vertiefung vorsichtig auf und ab pipettieren, um alle Bead-Cell-Komplexe/Aggregate aufzubrechen. Sammeln Sie die Suspension aus allen Vertiefungen in einem 5-ml-Polystyrolröhrchen.
4. Legen Sie das Röhrchen mit der Suspension in denselben Zellisolationsmagneten, der zuvor für die Aufreinigung von T-Zellen verwendet wurde, und lassen Sie es 5 Minuten ruhen.
5. Übertragen Sie die T-Zell-Suspension in ein neues Polystyrolröhrchen, indem Sie den Magneten festhalten und die Lösung in einer Bewegung ausgießen.
6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min. Suspendieren Sie die Zellen erneut in frischem Splenozytenmedium, um eine Konzentration von 2 x 10⁶ Zellen/ml zu erhalten.
7. Beurteilung der GFP-Expressionsintensität durch Durchflusszytometrie (optional zur Qualitätskontrolle) 12 bis 24 Stunden nach der Stimulation im Vergleich zu nicht aktivierten T-Zellen. ¹²
   Anmerkung: Die GFP-Fluoreszenz ist den Nur77^GFP T-Zellen intrinsisch und manifestiert sich nach erfolgreicher Aktivierung des T-Zell-Rezeptors TCR.
8. Zur Beurteilung der Lebensfähigkeit und Aktivierung (optional) durch Mikroskopie färben Sie die aktivierten Zellen 30 min vor der Analyse bei einer Konzentration von 0,2 μg/ml mit Hoechst. Geben Sie ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension auf einen Objektträger oder eine Vertiefung einer 384-Well-Platte mit flachem Boden und schwarzer Seite und untersuchen Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop, um lebende Zellen zu beurteilen. Tote Zellen behalten die Kernfärbung nicht bei.

>5. Hochdurchsatz-Screening (HTS) von kleinen Molekülen

1. Bereiten Sie eine Zellsuspension in Höhe von 2 x 10⁶ Zellen/ml der aktivierten T-Zellen (magnetische Kügelchen oder Antikörper/CD40L) oder nicht aktivierter Gruppen vor.
2. Platte 75.000 Zellen/Well in einer 384-Well-Platte (Volumen von 40 μl). Verwenden Sie eine 384-Well-Platte mit flachem Boden und schwarzer Seite oder einen Objektträger für die Beurteilung der Lebensfähigkeit und Aktivierung durch Fluoreszenzmikroskopie (optionaler Qualitätskontrollschritt vor HTS) unter Verwendung von Hoechst-Farbstoff (siehe Schritt 4.8 für Details).
3. Geben Sie manuell oder mit einem automatisierten System die Arzneimittel Ihrer Wahl (gelöst in 0,5 % Dimethylsulfoxid, DMSO) in jede Vertiefung.
4. Fügen Sie das Fahrzeug (DMSO) zu den positiven (aktivierten) und negativen (nicht aktivierten) Kontrollvertiefungen hinzu. Passen Sie die DMSO-Konzentration auf maximal 0,5 % an.
5. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang (oder Inkubationszeit nach Wahl) bei 37 ºC und 5 % Kohlendioxid, CO₂.
6. Am Tag des Screenings verdünnen Sie die Hoechst 33342 Färbelösung (1:3.333; z. B. 10 μl zu den Zellen in den 384-Well-Platten, um ein Gesamtvolumen von 50 μl zu erhalten). 30 min vor der GFP-Analyse durch Zugabe von Hoechst-Lösung färben, um eine Konzentration von 0,2 μg/ml zu erreichen.
7. Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig auf und ab, um eine homogene Verteilung in jeder Vertiefung zu erhalten.
   Anmerkung: Dieser Schritt ist wichtig bei der Abgabe der Medikamente (Schritt 5.3) mit einem automatisierten System, da sich die Zellen an einer Seite der Vertiefung ansammeln, entgegen der Strömungsrichtung.
8. Die Teller bei 45 x g für 3 min bei Raumtemperatur drehen.
9. Lassen Sie die Teller 15 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.
10. Führen Sie die Auslesung der Platte(n) mit dem automatisierten konfokalen High-Content-Screening-System (HCS) durch. Legen Sie die Platte in die Maschine ein. Stellen Sie das Objektiv auf eine 40-fache oder höhere Vergrößerung ein. Verwenden Sie Kamera #4 für Hoechst (UV-Lampe) und Kamera #1 für GFP (Laser 488). Richten Sie die Maschine so ein, dass sie 6-10 Felder pro Vertiefung lesen kann. Stellen Sie das Gerät so ein, dass es zwei sequenzielle Messungen pro Feld bei 488 nm (zum Lesen von GFP) und UV-Licht (zum Lesen von Hoechst) durchführt. Stellen Sie das Objektiv auf 40-fache oder höhere Vergrößerung ein.
    Anmerkung: Bei dem System handelt es sich um ein computergestütztes Mikroskop, das keine Anpassungen erfordert. Die Brennweite, die Intensität des einfallenden Lichts und die Belichtungszeit werden vom Gerät automatisch eingestellt.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nur77GFP-Mäuse	Das Jackson-Labor	Maus-Stamm Nr. 016617	In unserer Tierhaltung wurde eine hauseigene Kolonie gegründet
96 Wells-U Kulturplatten, steril	VWR Deutschland	Tel.: 10062-902	T-Zell-Aktivierung mit den magnetischen Kügelchen
70μm Zellsieb, steril	Corning Inc.	Artikel-Nr.: 352350	Erzeugung von Splenozyten-Zellsuspension
5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen, steril	Corning Inc.	352058	Erzeugung von Splenozyten-Zellsuspension
50 ml Röhrchen aus Polypropylen mit konischem Boden, steril	VWR Deutschland	Artikel-Nr.: 89039-656	Erzeugung von Splenozyten-Zellsuspension
10 ml Spritze ohne Nadel, steril	Becton, Dickinson und Co.	305482	Um die Milz zu zerdrücken
5 ml Zellkulturschale, steril	Greiner Bio-One	627 160	Um die Milz zu zerdrücken
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	WISENT Inc.	450-200-EL	Bestandteil des Splenozytenmediums
RPMI 1600 mit Natriumbicarbonat und L-Glutamin	WISENT Inc.	350-002-CL	Bestandteil des Splenozytenmediums
MEM-nicht-essentielle Aminosäuren	WISENT Inc.	321-010-EL	Bestandteil des Splenozytenmediums
HEPES freie Säure 1 M	WISENT Inc.	Artikel-Nr.: 330-050-EL	Bestandteil des Splenozytenmediums
Natriumpyruvat-Lösung (100mM)	WISENT Inc.	600-110-EL	Bestandteil des Splenozytenmediums
Fötales Rinderserum (FBS)	WISENT Inc.	Tel.: 080-910	Bestandteil des Splenozytenmediums und des Durchflusszytometrie-Puffers
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	WISENT Inc.	311-010-CL	Bestandteil des Durchflusszytometrie-Puffers
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 21985-023	Bestandteil des Splenozytenmediums
T-Zellen Isolationskit	Stammzellen-Technologien	19851	So isolieren Sie T-Zellen
Maus T-Aktivator CD3/CD28 superparamagnetische Kügelchen	Thermo Fisher Scientific	11452D	So aktivieren Sie T-Zellen
Magnet zur Isolierung von Zellen	Stammzellen-Technologien	Nr. 18000	Um T-Zellen zu isolieren und die magnetischen Kügelchen zu entfernen
Rekombinante Maus IL-7	Peprotech	Nr. 217-17	Zur Unterstützung des Überlebens der T-Zellen während der Aktivierung
Anti-Maus-CD3-Antikörper	BD Pharmingen	561799	Zur Färbung von T-Zellen für die Durchflusszytometrie
Biomed FXp	PerkinElmer Inc.	Nr. A31842	Zur Resuspendierung von Zellen nach 24 Stunden Inkubation
Opera Phenix High-Content-Screening-System	PerkinElmer Inc.	HH14000000	Zur Analyse des GFP/Hoechst-Signals