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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Einrichtung des Instruments
HINWEIS: Um schwebende Zellen abzubilden, müssen zwei Seltenerd-Neodym-Magnete, die auf der z-Achse magnetisiert sind, mit demselben Pol zueinander platziert werden, um ein Magnetfeld zu erzeugen. Der Abstand zwischen den Magneten kann je nach Intensität des Magnetfeldes und Dichte der Ziele angepasst werden. In diesem Fall sind die Magnete durch einen 1 mm großen Abstand getrennt, der für das Einsetzen eines 50 mm langen quadratischen Glaskapillarrohrs ausreicht. Das Gerät wurde mit einem AutoCAD-Design 3D-gedruckt, das auf Anfrage erhältlich ist.
- Legen Sie das Mikroskop perfekt waagerecht auf die Seite.
Anmerkung: Ein Mikroskop, das in einer aufrechten Standardposition aufgestellt wird, ist aufgrund der Positionen der Magnete in Bezug auf Kondensor und Objektiv nicht direkt für die Abbildung schwebender Objekte geeignet. Diese Einschränkung kann umgangen werden, indem das Mikroskop auf die Seite gelegt wird, perfekt horizontal, so dass der Kondensor das Licht in die Kapillare fokussieren kann und die Objektivlinse die zwischen den Magneten schwebende Zelle abbilden kann, während die Anforderungen an die Köhler-Beleuchtung erfüllt bleiben.
- Stützen und nivellieren Sie den Ständer auf einem Steckbretttisch mit 2 oder 3 Laborhebern.
- Um Vibrationen zu begrenzen, stützen Sie den Breadboard-Tisch mit Gummi-Dämpfungsfüßen ab.
- Entfernen Sie den Tisch und ersetzen Sie ihn durch eine kompakte Laborbuchse zum Einstellen der Höhe des Schwebegeräts (y-Achse) und zwei einachsige Translationstische: einen zum Einstellen des Fokus (z-Achse) und den zweiten zum Scannen des Kapillarrohrs.
- Befestigen Sie das Magnetschwebegerät mit zwei optischen Stiften der Mini-Serie an der Laborbuchse
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>2. Bindung von Antikörpern an Carboxy-Mikropartikel/Beads (modifiziert von einem Protokoll von PolyAn)
HINWEIS: Für den Nachweis von Rhesus, Rh(+) müssen nur Kügelchen mit niedriger Dichte (1,05 g/ml) beschichtet werden, aber sowohl Kügelchen mit hoher als auch mit niedriger Dichte werden für den Nachweis extrazellulärer Vesikel beschichtet.
- Nehmen Sie 1 mg Äquivalent der Bead-Suspension heraus und geben Sie in 0,5 mL Aktivierungspuffer (50 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, MES (MW195.2, 9,72 mg in 1 mL)) pH 5,0 und 0,001% Polysorbat-20).
- 12 μl frisch hergestelltes 1,5 M 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC) (MW 191,7, 0,28755 g in 1 ml) und 12 μl 0,3 M Sulfo-N-Hydroxysuccinimid (NHS) (MW 217,14, 0,0651 g in 1 ml) in eiskaltes Wasser geben.
- Die Röhrchen auf einen Orbitalschüttler legen und 1 h lang bei Raumtemperatur kräftig schütteln, um die Carboxylgruppen auf den Kügelchen zu aktivieren.
- Stoppen Sie die Aktivierung nach 1 h durch Zugabe von 0,5 mL Coupling Buffer (10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS oder 0,1 M Phosphat pH 7-9).
- Pelletieren Sie die Kügelchen, indem Sie 10 Minuten lang bei 20.000 x g zentrifugieren, oder, wenn die Kügelchen nicht pelletiert werden können, verwenden Sie einen 0,45 μm Zentrifugenröhrchenfilter. Aspirieren Sie den Überstand oder Durchfluss.
- Waschen Sie die Kügelchen mit 1 mL 10x PBS 3 x wie in Schritt 2.5.
- Berechnen Sie 25 μg Antikörper pro mg Kügelchen und mischen Sie den gewünschten Antikörper mit aktivierten Kügelchen auf eine endgültige Antikörperkonzentration von 0,7-1,0 mg/ml in 10X PBS.
- Platzieren Sie die Rohre auf einer Rohrwippe, die auf niedrige Geschwindigkeit eingestellt ist. Rollen Sie die Rohre zum Ankoppeln über Nacht vorsichtig bei Raumtemperatur auf.
- Wiederholen Sie Schritt 2.5 und waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 1 mL 10x PBS.
- Mit 0,5 mL 1 M Ethanolamin (98 % Stamm = 16,2 M) in einem Puffer pH 8,0 mit 0,02 % Polysorbat-20 für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln waschen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.5 und waschen Sie die Kügelchen einmal in 1 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS). Die Kügelchen können bis zur Verwendung in 200 μl DPBS bei 4 °C gelagert werden.
Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
>3. Entnahme und Aufbereitung von Blut für den Rh(+)-Nachweis
- Stechen Sie mit einer Ein-Klick-Stechhilfe in den Finger eines Rh(+)-Spenders und sammeln Sie 10 μl Blut in 1 ml DPBS.
- Färben Sie die Rh+-Zellen mit einer fluoreszierenden Plasmamembranfärbung. Optional fügen Sie 1 μl Fluoreszenzfarbstoff zur 1 ml-Suspension der Rh+-Zellen hinzu (1:1000 Verdünnung).
- Inkubieren Sie die Zellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff bei 37 °C für 15 min.
- Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie sie 15 s lang bei 5.600 x g schleudern und 3 Mal mit 1 mL DPBS waschen. Resuspendieren Sie in 1 ml Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS) mit Calcium und Magnesium (HBSS++).
- Mit der Ein-Klick-Stechhilfe stechen Sie in den Finger eines Rh(-)-Spenders und sammeln Sie 2 μl Blut.
Anmerkung: Wenn Sie mehr als 2 Bedingungen vorbereiten, sammeln Sie genügend Blut, um 1 μl Rh(-)-Blut in jedes Röhrchen zu geben.
- Bereiten Sie die erforderlichen Versuchsröhrchen vor: Nur Kügelchen, Immunglobulin G (IgG)-Kontrolle, Probe.
- Nur Kügelchen: Fügen Sie 174 μl HBSS++, 1 μl IgG-Kontrollkügelchen, 1 μl Kügelchen mit hoher Dichte (1,2 g/ml) und 24 μl 500 mM Gd3+ (60 mM) hinzu.
- IgG-Kontrolle: Fügen Sie 172 μl HBSS++, 1 μl IgG-Kontrollkügelchen, 1 μl Kügelchen mit hoher Dichte, 1 μl Rh-Blut, 1 μl gefärbte Rh+-Blutsuspension und 24 μl 500 mM Gd3+ hinzu.
- Das Probenröhrchen fügt 172 μl HBSS++, 1 μl anti-RhD-beschichtete Kügelchen, 1 μl Kügelchen mit hoher Dichte, 1 μl Rh-Blut, 1 μl gefärbte Rh(+)-Blutsuspension und 24 μl 500 mM Gd3+,
hinzu
Anmerkung: Rh-Proben werden als Referenz mit Kügelchen mit hoher Dichte zugesetzt.
4. Analysieren von Zellen auf dem Magnetschwebegerät
- Führen Sie die Inbetriebnahme des Geräts gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
- Geben Sie 50 μl Probe in ein Kapillarröhrchen, bis das Röhrchen gefüllt ist. Versiegeln Sie die Enden des Kapillarrohrs mit Kapillardichtmittel und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
- Legen Sie das Kapillarrohr in die Halterung zwischen dem oberen und unteren Magneten. Passen Sie den Tisch und den Fokus für eine optimale Betrachtung an.
Anmerkung: Zellen/Kügelchen können zwischen 5 und 20 Minuten brauchen, um ihre magnetische Gleichgewichtsposition zu erreichen, basierend auf ihrer Dichte und der Konzentration von Gd3+. Je höher die Konzentration von Gd3+, desto kürzer die Zeit.