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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Isolierung von CD4+ T-Zellen für eine Bildanalyse
- Tauen Sie ein 1-ml-Aliquot auf, das 107 eingefrorene mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) oder mononukleäre Lymphknotenzellen (LNMCs) aus entnommenen Proben enthält. Geben Sie die aufgetauten Zellen in einer sterilen Haube zu 9 ml RPMI, das mit Penicillin/Streptomycin und Glutamin ergänzt wurde.
- Zentrifugieren Sie die Zellen für 10 min bei 300 x g bei 4 °C, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5 mL supplementiertem RPMI, das 10% FBS (vollständiges Medium) enthält. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem CO2 -Inkubator bei 37 °C.
- Am nächsten Tag reinigen Sie CD4+ T-Zellen durch negative immunomagnetische Sortierung mit einem im Handel erhältlichen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Um die Anzahl der frisch gereinigten CD4+ T-Zellen zu messen, mischen Sie 5 μl der Zellsuspension mit einem gleichen Volumen einer Trypanblau-Lösung. Beladen Sie ein Hämozytometer mit einer Zell-Trypanblau-Mischung und zählen Sie die lebenden Zellen in den 5 Abschnitten des Hämozytometers.
- Nehmen Sie den Durchschnitt der Zellzahl und bestimmen Sie die Anzahl der Zellen in der ursprünglichen Zellsuspension: die Anzahl der Zellen/1 ml = die durchschnittliche Anzahl x 2 x 104. Wenn die Gesamtzahl der isolierten Zellen zu klein ist, verwenden Sie die Zellen unverändert, ohne sie zu zählen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 300 x g und resuspendieren Sie sie in einem Assay-Puffer (20 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-Glucose, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 und 1 % humanes Serumalbumin) bei 105 Zellen/50 μl oder weniger und halten Sie die Zellen bei 4 °C (für 1–2 h), bis sie bereit sind, Verwendung in den Experimenten.
- Entsorgen Sie alle biologischen Abfälle gemäß den einschlägigen institutionellen Richtlinien.
- Falls gewünscht, als Kontrollzellpopulation aktivierte CD8+ T-Zellen aus PBMC aus Nabelschnurblut präparieren, 107 Zellen in 5 ml vollständiges Medium in einen T25-Kulturkolben geben, der mit einer Mischung aus Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern bei 10 μg/ml bzw. 1 μg/ml bedeckt ist.
- Am nächsten Tag nehmen Sie die aktivierten Nabelschnurblutzellen aus dem Kolben, waschen Sie sie 1x mit frischem Vollmedium und expandieren Sie die Zellen in Gegenwart von rekombinantem IL-2 (100 U/ml) für 2 Wochen.
- Reinigen Sie die CD8+ T-Zellen aus Nabelschnurblut durch negative immunomagnetische Sortierung mit dem im Handel erhältlichen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zählen Sie die Zellen und tauschen Sie das Medium gegen den Assay-Puffer aus, wie in den Schritten 1.3 bis 1.6 für LN- und PB CD8+ T-Zellen beschrieben.
>2. Komponenten für die Herstellung der planaren Lipiddoppelschichten
- Bereiten Sie 3 Arten von Liposomen her, wie an anderer Stelle beschrieben: (a) 0,4 mM DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin) Liposomen, (b) 0,4 mM DOPC-Liposomen mit 33 mol% DOGS-NTA (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-Amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (Ammoniumsalz)) Lipide, (c) 0,4 mM DOPC-Liposomen mit 4 mol% Biotinyl-Cap-PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Kapbiotin) (Natriumsalz)).
- Bereiten Sie 5%ige Kaseinlösung wie zuvor beschrieben vor.
- 5 g Kaseinpulver in 100 mL Reinstwasser auflösen und 350 μl 10 M Natriumhydroxid zugeben. Alles auf einem normalen Magnetrührer entsprechend der verfügbaren Skala bei langsamer Geschwindigkeit umrühren, 2 h lang bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4 °C. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 ein und zentrifugieren Sie die Lösung 2 h lang bei 100.000 x g bei 4 °C. Filtrieren Sie den Überstand mit einem 0,22 μm Sterilfilter und lagern Sie die Lösung in Aliquoten bei -80 °C.
Vorsicht: Natronlauge kann Verätzungen verursachen und bei Kontakt mit den Augen zu dauerhafter Erblindung führen. Verwenden Sie Gummihandschuhe, Sicherheitskleidung und Augenschutz, wenn Sie mit dieser Chemikalie oder ihren Lösungen umgehen.
- Markierung von Anti-CD3-Antikörpern mit Biotin, um mono-biotinylierte Antikörpermoleküle mit einem zuvor beschriebenen Ansatz herzustellen.
- Bereiten Sie eine Lösung von Biotin-PEO4-NHS in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Menge von 0,1 mg/ml vor. Fügen Sie 3,7 μl der Biotin-PEO4-NHS-Lösung zu 1 mg Antikörper in 0,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzu, die 100 mM Natriumbicarbonat enthält.
- Inkubieren Sie die Mischung 2 h lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie eine Lösung von Alexa Fluor 488 NHS-Ester in 10 mg/ml DMSO vor. Geben Sie die Alexa Fluor 488 NHS-Esterlösung zu dem von Biotin-PEO4-NHS markierten Antikörper in einem 10-fachen molaren Überschuss.
- Inkubieren Sie die Mischung 1 h lang bei Raumtemperatur unter langsamem Rühren auf einem normalen Magnetrührer. Trennen Sie den ungebundenen Farbstoff mit Hilfe der Größenausschlusschromatographie.
- Bestimmen Sie die Antikörperkonzentration, indem Sie die optische Dichte der Antikörperlösung bei 280 nm (A280) messen. Messen Sie die optische Dichte der markierten Antikörper bei 577 nm (A577).
- Bestimmen Sie das Verhältnis von Farbstoff zu Antikörper anhand der folgenden Gleichung:
Anmerkung: Weitere Details finden Sie im Protokoll des Herstellers.
- Exprimieren Sie ein rekombinantes lösliches Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Protein in einem Drosophila-Expressionssystem, wie zuvor beschrieben.
- Klonieren Sie die Ektodomäne von ICAM-1 mit cDNA-Kodierung in den Drosophila-Expressionsvektor pMT/V5-His mit einem induzierbaren Metallothionein-Promotor, um ein rekombinantes Protein herzustellen, das mit einem His6-Tag am C-terminalen Ende angehängt ist.
- Co-transfiziert S2-Zellen mit dem resultierenden ICAM-1-haltigen Plasmid und einem genetischen (G418)-Expressionsvektor. Wählen Sie stabile Transfektantien unter Verwendung von Drosophila Media von Schneider, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) und 0,5 mg/ml G418 für 3 Wochen. Expandieren Sie die Zellen in serumfreiem Insektenmedium und induzieren Sie eine Proteinexpression mit 0,5 mM CuSO4 für 3 d.
- Der Kulturüberstand wird 10x konzentriert und über einen Tangentialflusskonzentrator wie zuvor beschrieben gegen PBS dialysiert.
- Der konzentrierte Kulturüberstand wird auf eine Säule aufgebracht, die Sepharose mit einem kovalent immobilisierten monoklonalen Anti-ICAM-1-Antikörper enthält, und eluiert das gebundene ICAM-1 mit einem 50 mM Glycinpuffer, pH 3,0. Neutralisieren Sie das eluierte ICAM-1-Protein sofort mit einem 2 M Tris-Puffer, pH 8,0.
- Dialysieren Sie das eluierte Material gegen PBS, pH 8,0, und geben Sie das dialysierte Material in eine Säule, die Ni-NTA (Nickel-Nitriloessigsäure) Agarose enthält. Eluierbares ICAM-1 mit 200 mM Imidazol, pH 8,0. Dialysieren Sie das eluierte Material gegen einen PBS-Puffer mit einem pH-Wert von 8,0.
- Markieren Sie das gereinigte ICAM-1 mit Cyanin5-N-Hydroxysuccinimide (Cy5 NHS)-Ester gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Anmerkung: Das beste endgültige Farbstoff-zu-Protein-Verhältnis beträgt 1:1.
- Herstellung von Fab-Fragmenten aus einem Anti-CD107a-Antikörper durch Papainverdauung und Aufreinigung der Fab-Fragmente durch Ionenaustauschchromatographie, wie zuvor beschrieben. Beschriften Sie die Fab-Fragmente mit Alexa Fluor 568 NHS-Ester gemäß den Anweisungen des Herstellers.
>3. Bildung von glasgestützten planaren Lipiddoppelschichten
- Bereiten Sie eine frische saure Piranha-Lösung vor, indem Sie 140 ml konzentrierte Schwefelsäure und 60 ml 30%iges Wasserstoffperoxid mischen. Waschen Sie die Glasdeckgläser für die Flow-Objektträger, indem Sie sie 30 Minuten lang in der sauren Piranha-Lösung einweichen. Halten Sie das Glasdeckglas mit einer Scherenzange aus Polypropylen fest.
Vorsicht: Piranha-Lösung ist ein extrem starkes Oxidationsmittel. Denken Sie daran, beim Umgang mit der Lösung immer eine Schutzbrille oder einen Vollgesichtsschutz zusammen mit dicken Gummihandschuhen zu tragen. Arbeiten Sie mit Piranha-Lösung nur unter einem Abzug. Vermeiden Sie es, es während des Gebrauchs zu erhitzen, zu transportieren oder zu schütteln, da es explodieren kann. Sammle die Piranha-Abfälle in einer Glasflasche mit einem bleihaltigen Loch. Wenden Sie sich an den Ausschuss für institutionelle Sicherheit, um sich über die ordnungsgemäße Abfallverwertung zu informieren.
- Spülen Sie die gewaschenen Deckgläser 7x mit Reinstwasser aus, indem Sie sie nacheinander in Bechergläser mit frischem Wasser umfüllen. Legen Sie die nassen Deckgläser beiseite, um das restliche Wasser vom sauberen Glas abperlen zu lassen, und lassen Sie das trockene Glas zurück.
- Alternativ können Sie eine Pipettenspitze, die an einer Vakuumpumpe befestigt ist, verwenden, um die restlichen Wassertropfen vorsichtig von den Deckgläsern zu entfernen.
- Führen Sie in der sterilen Haube Verdünnungen verschiedener Lipide durch, um die Liposomenmischung zur Herstellung von Doppelschichten herzustellen. Kombinieren Sie zunächst 37 μl DOPC-Liposomen und 3 μl Biotinyl-Cap-PE-Liposomen. Mischen Sie zweitens 14 μl DOPC-Liposomen und 15 μl DOGS-NTA-Liposomen. Drittens, fügen Sie 1 μl der ersten Mischung zu 29 μl der zweiten Mischung hinzu, um die endgültige Liposomenmischung herzustellen.
- Richten Sie in der sterilen Haube einen Arbeitsbereich mit trockenen Deckgläsern in der Nähe ein. Aliquotieren Sie 2 μl des endgültigen Liposomengemisches (siehe Schritt 3.3) genau in der Mitte eines selbstklebenden Gleitkanals. Richten Sie sofort und sehr präzise ein sauberes und trockenes Deckglas auf dem Objektträger aus und senken Sie das Deckglas vorsichtig auf der klebrigen Seite des Objektträgers ab.
- Wenn Sie mehr als einen Objektträger vorbereiten, arbeiten Sie jeweils an einem Objektträger, da die Liposomenmischung schnell verdunstet. Drehen Sie den Objektträger um und üben Sie mit dem Außenring einer Polypropylen-Scherenzange einen sanften Druck auf den peripheren Kontakt des Deckglases mit dem Objektträger aus, wobei Sie darauf achten müssen, dass der Gleiter fest mit dem Objektträger verbunden ist, um ein Auslaufen auszuschließen.
Anmerkung: Drücken Sie nicht gegen die Kanäle des Objektträgers, um ein Brechen oder Reißen des Deckglases zu vermeiden.
- Drehen Sie die Folie erneut um und markieren Sie die Position der gebildeten Doppelschicht, die wie ein Tropfen zwischen Deckglas und Kanalschieber aussieht, indem Sie 4 Punkte mit einem Permanentmarker um die Doppelschicht auf der äußeren Schiebeseite der Baugruppe zeichnen.
- Vor der ersten Injektion einer Flüssigkeit in den Kanal ist eine Öffnung des Kanals als Eintrittsöffnung und die andere als Austrittsöffnung zu bezeichnen und diese Bezeichnung während des gesamten Experiments beizubehalten.
- Um Blasenbildung zu vermeiden, führen Sie das Ende der Pipettenspitze direkt in die Eintrittsöffnung des Kanals ein. Füllen Sie die Kanäle des Objektträgers langsam mit 50 μl warmem (mindestens Raumtemperatur) Assay-Puffer (siehe Schritt 1.5 für die Pufferzusammensetzung).
- Bereiten Sie eine 0,5 M Nickel(II)-chlorid-Lösung vor. Tauen Sie ein aliquotes 2 mL Kaseinlösung in einem Wasserbad bei 37 °C für 30 min auf und ergänzen Sie es mit einer Nickelchloridlösung in einer Endkonzentration von 200 μM.
- Waschen Sie die Doppelschichten, indem Sie zuerst 100 μl der Kaseinlösung in die Eintrittsöffnung des Kanals injizieren und dann sofort 100 μl durch Pipettieren aus der Austrittsöffnung am Objektträger entfernen. Blockieren Sie die Doppelschichten mit der gleichen Lösung, indem Sie 100 μl der Kaseinlösung in die Eintrittsöffnung jedes Kanals injizieren und den Objektträger 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
- Tauen Sie Aliquots von Cy5-ICAM-1-His6 und Streptavidin-Proteinen auf. Kombinieren Sie die Proteine im Assay-Puffer in einer Endkonzentration von jeweils 2 μg/ml. Die Lösung wird 30 Minuten lang bei 20.000 x g und 4 °C zentrifugiert, um alle Zuschlagstoffe zu entfernen.
- Entfernen Sie den Rest der Blockierlösung durch Pipettieren aus der Austrittsöffnung des Objektträgerkanals. Injizieren Sie 100 μl der Lösung, die ICAM-1 und Streptavidin enthält, in die Eintrittsöffnung.
- Inkubieren Sie den Objektträger 45 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie überschüssige Proteinlösung aus der Austrittsöffnung. Waschen Sie die Doppelschicht 2x, indem Sie zuerst 100 μl des Assay-Puffers in die Eintrittsöffnung des Kanals injizieren und dann sofort 100 μl aus der Austrittsöffnung entfernen.
- Verdünnen Sie einen mit Alexa-Fluor-488 markierten Anti-CD3-Antikörper mit dem Assay-Puffer auf eine Endkonzentration von 2 μg/ml. Injizieren Sie 100 μl der Antikörperlösung in die Eintrittsöffnung des Objektträgers und inkubieren Sie ihn 45 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie überschüssige Proteinlösung aus der Austrittsöffnung. Waschen Sie die Doppelschicht 2x mit 100 μl des Assay-Puffers wie in Schritt 3.11.
>4. Bildgebung der Interaktion der T-Zellen mit der planaren Doppelschicht
- Heizen Sie den Tisch und das Objektiv eines konfokalen oder Totalreflexionsfluoreszenzmikroskops (TIRF) vor, bis die Temperatur auf 37 °C ausgeglichen ist. Richten Sie den Objektträger mit der/den Doppelschicht(en) auf dem beheizten Tisch ein. Bewegen Sie den Tisch entsprechend den Tintenmarkierungen in eine geeignete Position und fokussieren Sie sich auf die Doppelschicht unter Verwendung der Fluoreszenz von Cy-markierten ICAM-1-Molekülen.
- Verwenden Sie ein 61X-Objektiv für das konfokale Mikroskop oder ein 100X-Objektiv für das TIRF-Mikroskop mit entsprechenden Filtereinstellungen.
- Für die Bildgebung der Granulafreisetzung mittels TIRF-Mikroskopie fügen Sie Alexa-Fluor-568-markierte Anti-CD107a-Antikörper-Fab-Fragmente in einer Endkonzentration von 4 μg/ml in die Zellsuspension ein, bevor Sie die Zellen in die Eintrittsöffnungen injizieren.
- Resuspendieren Sie die vorbereiteten CD4+ T-Zellen, die aus LN PB oder Nabelschnurblut isoliert wurden, und injizieren Sie 50 μl der Zellsuspension in die Eintrittsöffnung des Objektträgerkanals, der die Doppelschicht enthält.
- Wählen Sie die gewünschte Anzahl an Feldern und nehmen Sie 30 Minuten nach der Injektion 1x alle 2 Minuten Bilder von jedem Feld auf.
- Nutzen Sie die Hellfeld-, Auflicht- und Fluoreszenzkanäle (Alexa 488 und Cy5) des konfokalen Mikroskops, um die Bilder aufzunehmen. Verwenden Sie den TIRF-Modus für die Fluoreszenz von Alexa-Fluor-488 und Alexa-Fluor-568 und das Weitfeld für die Cy5-Fluoreszenz sowie die Hellfeldbildgebung am TIRF-Mikroskop.