Wirkung eines immunmodulatorischen pharmakologischen Wirkstoffs auf die Interaktion zwischen dendritischen Zellen und CD4+ T-Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Wei, H., et al. Entwicklung und funktionelle Charakterisierung von tolerogenen dendritischen Zellen der Maus. J. Vis. Exp. (135), (2018).

Dieses Video zeigt eine Methode zur Umwandlung von dendritischen Zellen (DCs) in tolerogene DCs (TolDCs) mit einem immunmodulatorischen pharmakologischen Wirkstoff. Diese Umwandlung wird durch die Bewertung der TolDC-Funktion durch ihre immunsuppressive Wirkung auf CD4+ T-Zellen bestätigt.

Protokoll

>1. Bewerten Sie die Funktion von TolDCs in vitro und in vivo

1. Syngener T-Zell-Proliferationsassay
   1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren und führen Sie das Experiment in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II mit geeigneten Sicherheitsverfahren durch.
   2. Bereiten Sie den MACS-Puffer mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA in 500 ml PBS vor. Sterilisieren Sie den Puffer durch Filtrieren durch einen 0,2-μm-Filter.
      Anmerkung: Lassen Sie den Puffer während des folgenden Experiments auf dem Eis.
   3. Um CD4+ T-Zellen zu erhalten, euthanasieren Sie OT-II T-Zell-Rezeptor (TCR)-transgene Mäuse im Alter von 8-10 Wochen mit einer CO₂ -Kammer. Legen Sie die Maus auf ein Präparierbrett und spülen Sie sie mit 70% Ethanol ab. Isolieren Sie die Milz von der linken Seite des Bauches mit einer chirurgischen Schere und Pinzette.
   4. Geben Sie die Milz mit 2 ml PBS in eine 6 cm große Kulturschale und verwenden Sie die Rückseite des Stecksticks einer 3 ml Spritze, um die Milz durch ein 40 μm Zellsieb zu zerkleinern.
   5. Die Zellsuspension auffangen und bei 300 x g 5 Minuten zentrifugieren.
   6. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 400 μl MACS-Puffer.
   7. 100 μl CD4+ T-Zell-Biotin-Antikörper-Cocktail bei 4°C für 5 Min. zugeben
      Anmerkung: Der Antikörper-Cocktail bindet an andere Zelltypen mit Ausnahme von CD4+ T-Zellen, wie CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC Klasse II, Ter-119 und TCRγ/δ.
   8. 300 μl MACS-Puffer und 200 μl Anti-Biotin-Kügelchen (Materialtabelle) bei 4 °C für 10 Minuten zugeben.
   9. Legen Sie die Säule aus ferromagnetischen Kugeln (Materialtabelle) und Vorabscheidefilter zusammen in das Magnetfeld und spülen Sie sie mit 3 ml MACS-Puffer aus.
   10. 9 ml MACS-Puffer in die Zellen geben und bei 300 x g 5 Minuten zentrifugieren.
   11. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 ml MACS-Puffer und tragen Sie es auf die Säule auf. Sammeln Sie Flow-Through, die CD4+ T-Zellen enthalten.
   12. Waschen Sie die Säule mit weiteren 3 ml MACS-Puffer und fangen Sie auch den Durchfluss auf.
   13. Um Milz-Pan-DCs zu erhalten, euthanasieren Sie C57BL/6-Mäuse im Alter von 8-10 Wochen mit einer CO₂ -Kammer. Legen Sie die Maus auf ein Präparierbrett und spülen Sie sie mit 70% Ethanol ab. Isolieren Sie die Milz von der linken Seite des Bauches mit einer chirurgischen Schere und Pinzette. Legen Sie die Milz in eine 6 cm große Kulturschale mit 2 ml Kollagenase-D-Lösung (2 mg/ml Kollagenase D, gelöst in HBSS, das Kalzium und Magnesium enthält).
   14. Injizieren Sie zweimal 1 ml Kollagenase D-Lösung mit einer 1 ml Spritze und einer 25G-Nadel in die Milz. Schneide die Milz mit einer kleinen Schere in kleine Stücke.
   15. Schütteln und bei Raumtemperatur 25 Minuten inkubieren.
   16. 500 μl 0,5 M EDTA bei Raumtemperatur für 5 Min. zugeben
       Anmerkung: Die Schritte von 1.1.13 bis 1.1.14 sind entscheidend für die Steigerung der Ausbeute von DCs.
   17. Verwenden Sie nun die Rückseite des Stecksticks der 3 ml-Spritze, um die Milzaufschlämmung durch ein 40 μm Zellsieb zu zerkleinern und die Zellsuspension durch Zentrifugieren bei 300 x g für 5 Minuten zu sammeln.
   18. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 350 μl MACS-Puffer, 50 μl FcR-Blockierungsreagenz und 100 μl Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail bei 4 °C für 10 Min.
       Anmerkung: Der Antikörper-Cocktail gegen Antigene, die nicht von DCs exprimiert werden.
   19. Waschen Sie die Zellen mit 9 ml MACS-Puffer und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 x g.
   20. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 800 μl MACS-Puffer und fügen Sie 200 μl Anti-Biotin-Kügelchen bei 4 °C für 10 Minuten hinzu.
   21. Wiederholen Sie die Schritte von 1.1.9 bis 1.1.11, um DCs zu sammeln.
   22. Waschen Sie die Säule zweimal mit weiteren 3 ml MACS-Puffer und fangen Sie auch den Durchfluss auf.
   23. Behandeln Sie die 2 x 10⁵ DCs/ml in Gegenwart oder Abwesenheit von 100-400 nM CDDO-DFPA bei 37 °C für 1 Stunde. Separat werden die CD4+ T-Zellen (1 x 10⁷/ml) 15 Minuten lang mit 1 μM CFSE bei 37 °C markiert, mit PBS gewaschen und das Volumen neu eingestellt, um die Endkonzentration auf 2 x 10⁶ T-Zellen/ml zu erhalten.
   24. Als nächstes werden in einer 96-Well-Platte 100 μl der behandelten dendritischen Zellen mit dem gleichen Volumen an CFSE-markierten CD4+ T-Zellen co-kultiviert, die beide aus den obigen Schritten entnommen wurden, um ein Verhältnis von 1:10 zu erhalten. Geben Sie nun 100 ng/ml Ovalbumin (OVA) Peptid 323-329 pro Vertiefung hinzu und messen Sie die CFSE-Intensität der T-Zellen mittels Durchflusszytometrie nach 2-3 Tagen Inkubation.
       Anmerkung: Die Zellzahlen und das Verhältnis von DCs und T-Zellen wurden aus unseren früheren Arbeiten optimiert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CDDO-DFPA (RTA-408)	Reata Pharmazeutika	Inhouse-Synthese	Zellkultur
Maus GM-CSF	Peprotech Inc	Nr. 315-03	BMDC-Differenzierung
Pan dendritische Zellisolationskit	Miltenyi Biotec AG	Tel.: 130-100-875	T-Zell-Proliferations-Assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antikörper Cocktail	Miltenyi Biotec AG	Tel.: 130-100-875	T-Zell-Proliferations-Assay
CD4+ T-Zell-Isolationskit	Miltenyi Biotec AG	Tel.: 130-104-454	T-Zell-Proliferations-Assay
CFSE	BioLegende	423801	T-Zell-Proliferations-Assay
FcR-Blockierungsreagenz	Miltenyi Biotec AG	Tel.: 130-100-875	T-Zell-Proliferations-Assay
Anti-Biotin-Mikroperlen	Miltenyi Biotec AG	Tel.: 130-104-454	T-Zell-Proliferations-Assay
1 ml Spritze	BD Biowissenschaften	309626	T-Zell-Proliferations-Assay
Bsa	Sigma Aldrich Inc	Nr. A2058	T-Zell-Proliferations-Assay
Edta	ThermoFisher Scientific	15575020	T-Zell-Proliferations-Assay
LS-Säule	Miltenyi Biotec AG	Tel.: 130-042-401	T-Zell-Proliferations-Assay
Vorabscheide-Filter	Miltenyi Biotec AG	Tel.: 130-095-823	T-Zell-Proliferations-Assay
Kollagenase D	Sigma Aldrich Inc.	11088858001	T-Zell-Proliferations-Assay
HBSS	ThermoFisher Scientific	14025076	T-Zell-Proliferations-Assay
Ovalbumin (OVA)-Peptid 323–329	Sigma Aldrich Inc.	Nr. O1641	T-Zell-Proliferations-Assay