Eine in vitro Technik zur Visualisierung der Exozytose von sekretorischen Granula in Mastzellen

Zusammenfassung

Quelle: Klein, O., et al. Bildgebung von FITC-dextran als Reporter für regulierte Exozytose J. Vis. exp. (2018).

Dieses Video zeigt eine Technik zur Visualisierung von Exozytose in Mastzellen. Die Zellen werden mit FITC-Dextran – einem fluoreszierenden Reporter – inkubiert, das von Zellen in sekretorischen Granulaten (SGs) aufgenommen wird, wo der saure pH-Wert seine Fluoreszenz löscht. Bei Stimulation der Granula-Exozytose induziert der höhere pH-Wert des Mediums eine Reporterfluoreszenz innerhalb der fusionierten SGs, die mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wird.

Protokoll

>1. Vorbereitungen

1. Vorbereitung von RBL-Nährmedien (RBL-2H3 Mastzelllinie)
   1. Mischen Sie 500 ml Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit niedrigem Glukosegehalt mit 56 ml fötalem Rinderserum (FBS), 5,5 ml Penicillin-Streptomycin-Nystatin-Lösung, 5,5 ml L-Glutamin-200-mM-Lösung. Dies führt zu einem niedrigen Glukose-DMEM-Gehalt, ergänzt mit 10 % FBS, 100 μg/ml Streptomycin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 12 Einheiten/ml Nystatin und 2 mM L-Glutamin.
   2. Das Medium wird mit einem Obervakuumfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm filtriert und bei 4 °C gelagert.
2. Wartung von RBL-Zellen.
   1. Züchten Sie RBL-Zellen bis zu einer maximalen Konfluenz von 90% in einer 10-cm-Schale. Wenn die Zellkultur gesund ist, sollten die Zellen eine Spindelform mit gelegentlichen Vorsprüngen haben.
   2. Für die Zellteilung die Zellen aus der Schale lösen, indem das Medium aspiriert und durch 2 ml Trypsin/EDTA-Lösung B ersetzt wird. 5-10 Minuten in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO₂ bei 37 °C inkubieren.
   3. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie mit einer Pipette 2 ml Kulturmedium hinzufügen und die Zellen im Verhältnis 1:2 - 1:10 aufteilen.
3. Vorbereitung von 20x Tyrode-Puffer
   1. Bereiten Sie eine 20-fache Stammlösung von 54 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 2,74 M NaCl und 8 mM NaH₂PO₄ in doppelt destilliertem Wasser (DDW) vor. Gut mischen und bei 4 °C lagern.

2. Kultur von RBL-Zellen für die Lebendzellmikroskopie

1. Herstellung der FITC-Dextran-Lösung.
   1. Mischen Sie 1 mg Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextranpulver (150 K) pro 1 ml Nährmedium (siehe Schritt 1.1.1). Bereiten Sie für ein vollkammeriges Deckglas 3 ml vor.
   2. Mit einer Celluloseacetat-Spritzenfiltereinheit mit einer Porengröße von 0,22 μm wird das gelöste FITC-Dextran filtriert.
   3. Geben Sie Maus-Immunglobulin E (IgE) in eine Konzentration von 1 μg/ml ein.
2. Aussaat von RBL-Zellen für die Bildgebung
   1. Am Tag vor der Bildgebung das Medium aus der Kulturschale aspirieren und durch 2 ml Trypsin/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Lösung B ersetzen. 5 - 10 Minuten in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ bei 37 °C inkubieren. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 2 ml Kulturmedium hinzufügen.
   2. Zählen Sie RBL-Zellen mit einem Hämozytometer und passen Sie das Volumen mit Kulturmedien entsprechend an, um eine Zellkonzentration von 7,5 x 10⁵/ml zu erhalten.
   3. 10 μl der Zellsuspension werden in ein gekammertes Deckglas gegeben, das mit frischem FITC-Dextran-supplementiertem Nährmedium vorgefüllt ist (dies führt zur Aussaat von 7,5 x 10³ Zellen in einer Kammer).
   4. Züchten Sie RBL-Zellen über Nacht in einer humifizierten Atmosphäre von 5 % CO₂ bei 37 °C. Die Zellen sollten auf einer subkonfluenten Ebene bleiben, um sicherzustellen, dass die Zellen getrennt sind und dass es einfach ist, jede Zelle einzeln unter dem Mikroskop zu identifizieren.
3. Transfektion von RBL-Zellen - optional.
   1. Zur Abbildung exozytärer Ereignisse in Kombination mit anderen fluoreszenzmarkierten Proteinen siehe Transfektionsprotokoll für RBL-Zellen in Azouz et al.

3. Lebendzellmikroskopie der Exozytose

1. Herstellung von Lösungen:
   1. Bereiten Sie eine endgültige Tyrode-Pufferlösung vor, indem Sie die Stammlösung in DDW in einer Verdünnung von 1:20 verdünnen und mit 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl₂, 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) und 5,6 mM Glukose ergänzen.
   2. Bereiten Sie ein 20-faches Sekretagogenreagenz in Tyrode-Puffer frisch vor [1 μg/ml Dinitrophenyl, konjugiert mit humanem Serumalbumin (DNP-HAS (Ag)), in unserem Fall, für eine 1x-Konzentration von 50 ng/ml].
   3. Bereiten Sie eine Ammoniumchloridlösung von 400 mM vor, indem Sie das Pulver in Tyrode-Puffer auflösen.
2. Vorbereitung der Zellen.
   1. Waschen Sie das Deckglas 3 Mal, indem Sie das Medium aus der Kammer ansaugen und mit 300 μl Tyrode-Puffer befüllen, der auf 37 °C vorgewärmt ist. Zum Schluss wird die Kammer mit 300 μl Tyrode-Puffer aufgefüllt, der auf 37 °C vorgewärmt wurde.
   2. Stellen Sie das Deckglas in die Inkubatorkammer des Mikroskops. Stellen Sie sicher, dass die Kammer stabil steht.
3. Einrichten des Mikroskops
   1. Um einen Bereich von Interesse für die Verfolgung auszuwählen, schalten Sie die Leuchtstoffröhrenlichtquelle ein (traditionell eine Quecksilberlampe) und wählen Sie den geeigneten Fluoreszenzfilter aus (wählen Sie den Filter für grüne Fluorophore zur Betrachtung von FITC-Dextran). Sobald der interessierende Bereich scharf ist und sich in der Mitte des Sichtfelds befindet, schalten Sie die Lichtquelle aus, um Lichtbleiche und Toxizität zu vermeiden.
      HINWEIS: Ein Teil des in den Zellen eingebauten FITC-Dextrans kann Fluoreszenz zurückhalten. Dies liegt daran, dass FITC-Dextran auch in nicht-lysosomale Kompartimente wie Endosomen einsortiert werden kann.
   2. Schalten Sie die entsprechende Beleuchtung für die FITC-Anregung ein. Wenn Sie ein laserbasiertes Mikroskop verwenden, schalten Sie den 488-nm-Laser ein. Die Emission sollte im Bereich von 500 - 550 nm erfasst werden (FITC-Emissionsspitzen liegen bei 510 - 520 nm).
   3. Wenn Sie ein Konfokalmikroskop verwenden, öffnen Sie die Lochblende maximal. Dies ermöglicht die Verwendung einer geringeren Laserleistung, um Bleichen und Toxizität zu vermeiden, und stellt sicher, dass Exozytoseereignisse aus allen Ebenen der Zelle erfasst werden.
   4. Kalibrieren Sie das Zeitintervall zwischen den Bildaufnahmen.
      1. Verschiedene Zellen können in ihrer Kinetik der regulierten Exozytose variieren. Für die spezifische Bildgebung der Substanzexozytose empfehlen wir ein Zeitintervall von mindestens 5 Sekunden. Als Faustregel gilt jedoch, dass Sie für eine schnelle Bildgebung sicherstellen sollten, dass die Erfassungszeit eines einzelnen Frames schnell ist.
      2. Wenn Sie ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop verwenden, stellen Sie die Scanrichtung auf bidirektional ein, lassen Sie keine Mittelwertbildung zu und stellen Sie die Auflösung auf 512 x 512 ein (empfohlen; die beiden letztgenannten Bestimmungen tragen auch dazu bei, das Ausbleichen und die Toxizität zu minimieren).
4. Bildgebung der Exozytose.
   1. Bilden Sie Zellen für die gewünschte Dauer ab, abhängig von der Art der Zelle oder des Sekretagogens. In RBL-Zellen, die mit IgE/Ag ausgelöst werden, treten die meisten exozytären Ereignisse innerhalb von 15 - 20 Minuten nach der Aktivierung auf.
   2. Zur Aktivierung der Zellen geben Sie 16 μl aus der 20x Sekretagogenlösung in die Kammer.
5. Bestätigung des Vorhandenseins von FITC-Dextran in den Zellen.
   1. Um das Vorhandensein und die Lokalisation von FITC-Dextran an den SGs zu bestätigen, geben Sie 16 μl Ammoniumchloridlösung (achten Sie darauf, die Kammer nicht zu bewegen, um den Fokus nicht zu verlieren) vorsichtig in die Kammer (dies ergibt eine Endkonzentration von 20 mM). Dies induziert eine Alkalisierung der SGs und eine Dequenchierung der FITC-Fluoreszenz, die innerhalb von Sekunden erfolgt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM niedriger Glukosespiegel	Biologische Induktionen	01-050-1A
Fötales Rinderserum	Gibco	Artikel-Nr.: 12657
Pen-Streptokokken-Nystatin-Lösung	Biologische Induktionen	03-032-1B
L-Glutamin 200 mM Lösung	Biologische Induktionen	03-020-1A
FITC Dextran 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Lösung B	Biologische Induktionen	03-052-1A	Vor Gebrauch im 37 °C warmen Wasserbad erwärmen
Obervakuumfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Spritzenvorsatz-Filtereinheit aus Celluloseacetat, 0,22 μm Porengröße	Schneidermuskel	16534K
Deckglas mit Kammer	Thermowissenschaftlich	155411
Mit Corning Gewebekulturen behandelte Kulturschalen	Sigma-Aldrich	CLS430167
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	Nr. A4503
Monoklonales Anti-DNP-IgE	Sigma-Aldrich	Nr. D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	Nr. A6661	Vermeiden Sie direkte Lichteinwirkung
Hepes-Puffer 1M, pH 7,4	Biologische Induktionen	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
Traubenzucker	BDH Laboratorien	284515V
Ammoniumchlorid	MERK	1145
PIPES Dikaliumsalz	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 108321-27-3
Calciumacetat-Hydrat	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 114460-21-8
Magnesiumacetat-Tetrahydrat	Sigma-Aldrich	M5661
Kaliumglutamat (L-Glutaminsäure, Kaliumsalz, Monohydrat)	Sigma-Aldrich	Nr. G1501
NaH2PO4	MERK	Artikel-Nr.: 6346
NaCl	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
Kcl	MERK	104936
Elektroporator	BTX	ECM830
Konfokalmikroskop, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Wird in Abbildung 3 verwendet. Ausgestattet mit einer elektronischen Temperaturregelung
Airstream Inkubator
Konfokalmikroskop, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Wird in Abbildung 2 verwendet. Ausgestattet mit einem GaAsP-Detektor, einem elektronisch temperierten
Airstream Inkubator
Konfokales Mikroskop, Leica	Leica	TP5	Wird in Abbildung 1 verwendet. Ausgestattet mit einem leica HyD-Detektor und einem Top-Stage-Inkubator (Okolab)
RBL-2H3-Zellen			RBL-2H3-Zellen wurden im Labor von Reuben P. Siraganian kloniert. Siehe Referenz 67

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