Überwachung der B-Zell-Aktivierung mit antigenen Liposomen mit einem Calcium-Flux-Assay

Zusammenfassung

Quelle: Bednar, K. J. et al., Antigene Liposomen zur Erzeugung krankheitsspezifischer Antikörper.J. Vis. Exp.(2018)

Dieses Video zeigt die Beurteilung der B-Zell-Aktivierung durch die Verwendung von antigenen Liposomen. B-Zellen, die mit dem calciumsensitiven Indo-1-Farbstoff behandelt wurden, werden mittels Durchflusszytometrie unterschieden und ihr Fluoreszenzverhältnis von Violett zu Blau analysiert. Wenn die Zellen auf antigene Liposomen treffen, löst es die B-Zell-Aktivierung durch Kalziumeinstrom aus, wodurch das Fluoreszenzsignalverhältnis von Violett zu Blau im Laufe der Zeit schrittweise verbessert wird.

Protokoll

>1. Konjugation von Proteinantigen an PEGyliertes Lipid

1. Geben Sie 3 g vernetzte Dextran-Gelkügelchen mit einem Fraktionierungsbereich von 1.500 bis 30.000 Dalton (Da) in einen 250-ml-Isolierkolben. Fügen Sie 60 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu und rühren Sie ständig mit einem magnetischen Rührstab um. Verschließen Sie den Kolben und halten Sie ihn an ein Vakuum, um die Entgasung auf einer Rührplatte für mindestens 1 h einzuleiten.
2. In einer 1,0 cm x 30 cm großen Glaschromatographiesäule mit geschlossenem Umsatzstopfen PBS in die zu waschende Säule geben. Öffnen Sie den Wendestopper und entleeren Sie die Säule. Nach dem Waschen die Aufschlämmung der entgasten Kügelchen in die Säule geben. Die Gülle wird kontinuierlich zugegeben, bis die Säule auf eine Perlenhöhe von ca. 24 cm gepackt ist.
3. Sobald die Säule einen "Kopf" von ca. 4–5 cm PBS über den gepackten Perlen hat, halten Sie die folgenden Schritte bereit.
   1. Erstellen Sie einen Schwerkraft-Strömungssiphon, indem Sie ein Stück Schlauch lang genug messen, um ein Regal 1-2 Fuß über der Oberseite der Säule zu erreichen, und erstellen Sie eine Schleife, die in der Nähe des unteren Teils der Säule abfällt und zum oberen Ende der Säule zurückkehrt. Bringen Sie an einem Ende des Schlauchs einen Wendestopfen an, wobei Sie eine Seite des Schlauchs offen lassen. Legen Sie das offene Röhrchenende in eine 500-ml-Flasche PBS und stellen Sie sie auf das Regal über der Säule.
   2. Nehmen Sie das Ende mit dem Wendestopfen und setzen Sie eine 10-ml-Spritze auf. Öffnen Sie das Wendeabsperrventil an der Schlauchleitung und ziehen Sie PBS durch den Schlauch. Sobald das PBS drei Viertel des Weges durch den Schlauch erreicht hat, entfernen Sie schnell die Spritze und setzen Sie den Wendestopfen oben auf die Säule – die Flüssigkeit sollte auf die Säule laufen.
      HINWEIS: Die Menge an PBS-Kopf, die oben in der Spalte verbleibt, sollte zwischen 1 und 3 cm liegen. Die Mindestmenge zum Waschen der Säule beträgt 3 Säulenvolumen.
4. Bestimmen Sie die Menge an Protein (Mol), die an Lipide gebunden werden soll, basierend auf seinem Molekulargewicht (MW).
   HINWEIS: Das Fab-Fragment des Anti-Maus-Immunglobulins IgM (selbst ein IgG) wird hier als universelles Surrogatantigen für die polyklonale Stimulation von B-Zellen verwendet. Dementsprechend hat das Fab-Fragment von Ziegen-IgG eine MW von etwa 48 KiloDalton (kDa) und ist in einer Gesamtmenge von 1,3 mg kommerziell verfügbar. Somit beträgt die Menge des zu verknüpfenden Proteins 27,1 μmol.
5. Bestimmen Sie den Extinktionskoeffizienten des interessierenden Proteins. Falls unbekannt, ist die Proteinabsorption bei 280 nm mit einem Spektralphotometer zu messen und der Wert A₂₈₀ durch die in Schritt 1.4.
   berechnete Molzahl zu dividieren. HINWEIS: Der Extinktionskoeffizient von Fab of goat IgG bei 280 nm beträgt 64.600 ^M-1.
6. Um sicherzustellen, dass Spuren des aminhaltigen Puffers entfernt werden, entsalzen Sie das Protein auf der in den Schritten 1.1–1.3 erstellten Säule und sammeln Sie die Proteinfraktionen in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (~500 μl pro Fraktion).
   1. Schließen Sie das an der Oberseite der Säule befestigte Absperrventil und entfernen Sie die Oberseite der Säule. Falls noch nicht geöffnet, öffnen Sie das Wendestopperventil am unteren Rand der Säule und warten Sie, bis der "Kopf" von PBS auf die Oberseite der Perlen trifft.
   2. Geben Sie das gewünschte Protein langsam mit einer Pasteur-Glaspipette auf die Oberseite der Kügelchen und achten Sie darauf, die Störung der Oberseite der Kügelchen zu minimieren.
   3. Sobald der "Kopf" der Proteinlösung die Oberseite der Kügelchen erreicht hat, fügen Sie vorsichtig 1 ml PBS über eine Pasteurpipette hinzu. Wiederholen Sie dies dreimal. Fügen Sie PBS hinzu, um einen Kopf von 4–5 cm zu erhalten, und wiederholen Sie Schritt 1.3, um die Säule zu waschen.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann übersprungen werden, wenn sicher ist, dass kein aminhaltiger Puffer vorhanden ist.
7. Bestimmen Sie die Fraktionen, die Protein enthalten, indem Sie A280-Werte messen, und fassen Sie die Fraktionen zusammen, die eine Rückgewinnung des Proteins von etwa 90 % ergeben.
   HINWEIS: Dadurch wird das Protein in der Regel um das 1,5- bis 2-fache verdünnt. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration nach dem Pooling. Konzentrieren Sie das Protein in diesem Schritt, falls erforderlich, mit einem Zentrifugationskonzentrator.
8. Fügen Sie dem Protein 2,5 molare Äquivalente des heterobifunktionellen Vernetzers hinzu.
   1. Wiegen Sie zunächst etwa 5 mg Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP, MW = 314 g/mol) in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Um das Volumen zum Auflösen des SPDP zu bestimmen, multiplizieren Sie die molare Proteinkonzentration und das 250-fache, um eine 100-fache Lösung zu erzeugen, die in der Reaktion einen Überschuss von 2,5 molaren ergibt.
      HINWEIS: Wenn die Proteinkonzentration beispielsweise 50 μM beträgt, wird eine Lösung von SPDP bei 12,5 mM benötigt. Für 5 mg SPDP entspricht dies 1,27 mL Dimethylsulfoxid (DMSO).
9. Fügen Sie SPDP in einer Verdünnung von 1:100 zu dem gewünschten Protein hinzu. Die Reaktion wird auf einem oszillierenden Schüttler bei Raumtemperatur (RT) für ca. 1 h durchgeführt.
10. Um überschüssiges SPDP zu entfernen und die endogene(n) Disulfidbindung(en) in dem Protein im nachfolgenden Reduktionsschritt zu schützen, äquilibrieren und waschen Sie die in den Schritten 1.1 bis 1,3 erzeugte Säule in 100 mM Natriumacetat (NaOAc) bei pH 5,5 oder erstellen Sie eine identische Säule ausschließlich zur Verwendung in diesem Puffer.
11. Nach 1 Stunde Inkubation mit SPDP entsalzen Sie das Protein auf der Säule, das in 100 mM NaOAc äquilibriert ist. Führen Sie diesen Schritt auf die gleiche Weise wie Schritt 1.6 durch, außer dass Sie 100 mM NaOAc (pH 5,5) als Eluent verwenden. Sammeln Sie die Brüche, ermitteln Sie den A₂₈₀ und fassen Sie die oberen Brüche zusammen. Waschen Sie die Säule in PBS.
12. Eine Lösung von 2,5 M DVB-T (MW = 154 g/mol) wird in doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O) hergestellt. Geben Sie 25 mM DTT für 5-10 min zu den gepoolten Proteinfraktionen.
13. Messen Sie den A₂₈₀ des Proteins und dividieren Sie diesen durch den Extinktionskoeffizienten. Ermitteln Sie auch die A₃₄₃. Das Verknüpfungsverhältnis wird anhand der Molarität des Proteins (A₂₈₀) und des Linkers (A₃₄₃) berechnet.
    HINWEIS: Deaktivieren Sie die automatische Kalibrierung des A340, wenn Sie ein Nanotropfen-Spektralphotometer verwenden. Die Messung A₃₄₃ stellt die Absorption der Pyridin-2-Thiongruppe (Extinktionskoeffizient = 7550 ^M-1) dar, die durch das DTT aus dem SPDP-Vernetzer entfernt wird. Ein molares Verhältnis von Linker: Protein von 1,2–1,5 wird im Allgemeinen erreicht, wenn die Reaktion mit einem 2,5 molaren Überschuss an SDPD an einer Vielzahl von Proteinen durchgeführt wird.
14. Führen Sie die gepoolten Fraktionen wie oben beschrieben über die in PBS gewaschene Säule. Sammeln Sie die Fraktionen, bestimmen Sie den A₂₈₀ und poolen Sie die oberen Fraktionen. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration durch A280 nach dem Poolen der Fraktionen.
15. Bereiten Sie DSPE-PEG(2000)-Maleimid (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(Polyethylenglykol)-2000)-Maleimid vor. Dieses wird dem Protein in einem molaren Verhältnis von 10:1 zugesetzt. Bereiten Sie eine 100-fache Brühe DSPE-PEG(2000)-Maleimid vor, um die gewünschte Konzentration zu erreichen.
    1. Wenn die Proteinkonzentration nach Schritt 1.14 beispielsweise 10 μM beträgt, ist ein Vorrat an DSPE-PEG(2000)-Maleimid bei 10 mM herzustellen. DSPE-PEG(2000)-Maleimid (MW = 3000 g/mol) vorsichtig abwiegen und die entsprechende Menge DMSO zugeben. Mehrere Runden sanften Vortexens und Beschallens können dazu führen, dass es sich vollständig auflöst.
16. Das Gesamtvolumen der Fraktionen aus Schritt 1.14 wird bestimmt und die Lösung vorsichtig in einen kleinen (10-25 ml) Rundkolben (RBF) überführt. Geben Sie die entsprechende Menge von 100x DSPE-PEG(2000)-Maleimid zum Protein, um eine 1x, 10-fache molare Überschuss-Endkonzentration zu erreichen. Schwenken Sie die Lösung vorsichtig, um sicherzustellen, dass das DMSO vollständig dispergiert ist.
17. Die Reaktion über Nacht unter Stickstoff in einem geschlossenen RBF durchführen lassen. Verwenden Sie ein Gummiseptum und legen Sie es in einen Abzug.
    1. Entfernen Sie die Atmosphäre, indem Sie das Septum mit einer 20-G-Nadel punktieren, die an einer 3-ml-Spritze am Ende des Schlauchs befestigt ist, der an einem Vakuum befestigt ist, und schalten Sie das Vakuum für 3–5 s ein.
    2. Ersetzen Sie die Atmosphäre durch Stickstoff. Füllen Sie einen Ballon, der an einer halbierten 3-ml-Spritze befestigt ist, mit Stickstoff und befestigen Sie eine 20-g-Nadel. Das Septum wird durchstochen, um die Atmosphäre im Inneren des Rundkolbens mit Stickstoff zu füllen. Wiederholen Sie die Entfernung der Atmosphäre und den Ersatz durch Stickstoff noch einmal und lassen Sie den Stickstoffballon über Nacht befestigt.
18. Bereiten Sie eine separate vernetzte Dextran-Gelperlensäule mit einem Fraktionierungsbereich von 4.000–150.000 Da in einer 1,0 cm x 50 cm großen Glaschromatographiesäule vor (gemäß den Schritten 1.1-1.3).
19. Am folgenden Tag wird das Protein aus dem in Schritt 1.17 hergestellten Rundkolben entnommen und über die vernetzte Dextran-Gel-Bead-Säule (aus Schritt 1.18) geführt (nach der in Schritt 1.6 verwendeten Methode).
    HINWEIS: Die Gesamtmenge, die auf die Säule geladen werden soll, sollte nicht mehr als 2 ml betragen. Wenn eine größere Reaktion verwendet wurde, teilen Sie sie in zwei auf und führen Sie sie auf separaten Säulen oder auf einer Säule mit größerem Durchmesser aus.
    1. Sammeln Sie die Fraktionen, bestimmen Sie den A₂₈₀, Pool-Top-Fraktionen und bestimmen Sie die Proteinkonzentration. Das Vorhandensein des Lipids hat keinen Einfluss auf die Messungen.
20. Die letzten gepoolten Fraktionen des lipidgebundenen Proteins werden bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert.

>2. Liposomen-Vorbereitung

1. Wiegen Sie die Lipide ab: DSPE-PEG(2000) (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000, MW = 2805,5 g/mol; Cholesterin (3b-Hydroxy-5-cholesten, 5-Cholesten-3b-ol), MW = 386,7 g/mol; und DSPC (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin), MW = 790,1 g/mol. Es wird eine 5 mg/ml-Lösung von DSPC, eine 4 mg/ml-Lösung von Cholesterin und eine 2 mg/ml-Lösung von DSPE-PEG (2000) in Chloroform hergestellt.
2. Es ist sicherzustellen, dass das molare Verhältnis der Lipide in den Liposomen beträgt: 57 % DSPC, 38 % Cholesterin und 5 % DSPE-PEG (2000), wie in Tabelle 1.
   dargestellt HINWEIS: Es ist wichtig, die Antigenmenge auf dem Liposom zu kontrollieren, die im Allgemeinen zwischen 0,01 und 0,1 % liegt. In Tabelle 1 werden 0,1 % des Anti-Maus-IgM-Fab-Fragments von Ziegen verwendet, das an PEGyliertes Lipid gebunden ist. Es ist wichtig, den 10-fachen molaren Überschuss an DSPE-PEG(2000)-Maleimid, der dem Protein in Schritt 1.15 zugesetzt wurde, zu berücksichtigen, um sicherzustellen, dass die Gesamtmenge an PEGyliertem Lipid 5 % nicht überschreitet
.
3. Berücksichtigen Sie die endgültigen Lipidmengen (μmol), wenn Sie Lipide für die Extrusion erstellen. In Tabelle 1 finden Sie ein Beispiel für die Berechnung der molaren Lipidkonzentrationen für die Bildung von Liposomen bei einer Gesamtlipidkonzentration von 1,25 μM.
4. Sobald die richtige Menge jedes Lipids, das addiert werden soll, berechnet wurde, kombinieren Sie alles in einem 12-ml-Reagenzglas aus Borosilikatglas.
5. Blasen Sie das Chloroform vorsichtig ab.
   1. Verwenden Sie den Schlauch und eine 3-ml-Spritze mit einer Nadel, die in Schritt 1.17.1 vorbereitet wurde, um das Chloroform in dem Röhrchen vorsichtig mit Stickstoff abzublasen. Blasen Sie vorsichtig einen Stickstoffstrahl auf die Lösung, während Sie das Rohr mit der anderen Hand drehen. Achten Sie darauf, dass die Flüssigkeit nicht mehr spritzt oder an der Seite des Rohrs hochläuft, da es im nächsten Schritt schwieriger sein kann, sie in Lösung zu bringen.
6. Geben Sie 100 μl DMSO in jedes Röhrchen und lyophilisieren Sie diese Lösung über Nacht. Decken Sie die Oberseite des Röhrchens mit einem nicht statischen Labortuch ab, befestigen Sie es mit einem Gummiband und frieren Sie es bei -80 °C ein.

>3. Liposomen-Extrusion

1. Geben Sie 1 ml PBS mit dem lipidgebundenen Protein in das 12-ml-Röhrchen mit den Lipiden. Beschallen Sie die Lösung für ca. 30 Sekunden bis 1 Minute in einem Beschallungswasserbad. Zwischen jeder Runde 5 Minuten oder länger ruhen lassen und 3–4 Mal wiederholen.
2. Bereiten Sie einen Extruder gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
   1. Setzen Sie die Filterstützen auf die interne Membranhalterung und geben Sie einige Tropfen (je 10 μl) PBS auf die Paraffinfolie. Fassen Sie mit einer Pinzette eine Kante der Filterhalterung und tauchen Sie sie in den 10-μl-Tropfen.
   2. Setzen Sie den Filter in den O-Ring ein. Tun Sie dies für beide Seiten. Nehmen Sie mit einer Pinzette einen 0,8-μm-Filter auf die Kante, tauchen Sie den 10-μl-Tropfen ein und beschichten Sie die Außenseite des O-Rings mit PBS. Platzieren Sie den 0,8-μm-Filter vorsichtig auf dem O-Ring, sodass der Filter nicht über die interne Membranhalterung hinausragt.
3. Legen Sie den Heizblock des Extruders auf eine Heizplatte, um den Extruder vorzuheizen. Schalten Sie die Heizplatte auf niedrige Stufe und lassen Sie den Heizblock des Extruders die gewünschte Temperatur erreichen. Um mögliche Probleme mit der Proteinaggregation zu vermeiden, erhitzen Sie den Block nicht über 37 °C hinaus.
4. Laden Sie die beschallte Probe in eine der Extrusionsspritzen, die in den Extruder eingelegt werden. Setzen Sie die Extruderspritze in das andere Ende des Extruders ein. Stellen Sie sicher, dass der leere Spritzenkolben auf Null gestellt ist. Die leere Spritze füllt sich, wenn das Lipid durch die Polycarbonat-Membran von 0,8 μm extrudiert wird. Versuchen Sie zu vermeiden, dass Blasen durch die Membran hin- und hergeleitet werden.
5. Setzen Sie den fertig montierten Extruder in den Heizblock ein. Schieben Sie den Kolben der mit Lipiden gefüllten Spritze vorsichtig auf die leere Spritze. Je nach Lipidkonzentration wird es schwierig sein, dies durchzusetzen. 20x wiederholen.
6. Entfernen Sie den fertig montierten Extruder aus dem Heizblock. Nehmen Sie die gefüllte Spritze langsam aus dem Extruder und achten Sie darauf, dass Sie alle Lipide auffangen, die beim Entfernen austreten könnten. Legen Sie die Liposomen in ein sauberes Fläschchen. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 bis 3.6 mit Membranen aus Polycarbonat mit 0,2 μm und 0,1 μm.
7. Erstellen Sie eine 0,7 x 50 cm große² vernetzte Agaroseperlensäule mit einem Trennbereich von 0,7-10 Mega Dalton (MDa), äquilibriert in PBS. Fügen Sie die Liposomen hinzu und gehen Sie wie in Schritt 1.6 vor. Fraktionen, die Liposomen enthalten, weisen eine verminderte Lichtdurchlässigkeit im Bereich von 250 bis 400 nm auf.
8. Lagern Sie die Liposomen bei 4 °C und frieren Sie sie nicht ein.

4. Kalziumfluss zur Überwachung der B-Zell-Aktivierung durch antigene Liposomen

1. Euthanasieren Sie Mäuse durch eine Überdosierung von Kohlendioxid (_{CO 2}) oder Isofluran gemäß den institutionellen Standardarbeitsanweisungen. Bestätigung der Euthanasie von Mäusen durch Zervixluxation.
2. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente und den Schlachtkörper der Maus mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie eine 10 cm lange, 0,8 mm lange, gebogene Iriszange, um die Haut, die die Brusthöhle bedeckt, vom Brustkorb zu trennen. Verwenden Sie eine 10 cm lange, gerade Präparierschere, um einen distalen Schnitt mit einem beidseitigen Schnitt zu machen.
3. Verwenden Sie eine gebogene Iriszange und eine Präparierschere, um die Milz aus der Bauchhöhle zu ziehen. Entfernen Sie das Fettgewebe, das die Milz umgibt, und legen Sie es dann in ein konisches 15-ml-Polystyrolröhrchen, das mit RPMI1640 Medium gefüllt ist, das 1 % fötales Kälberserum (FCS) und Penicillin-Streptomycin enthält.
4. Übertragen Sie Milz und Medien über ein 40-μm-Zellsieb, das auf einem konischen 50-ml-Röhrchen montiert ist. Zerdrücken Sie die Milz vorsichtig mit dem Gummiende eines 3-ml-Spritzenkolbens. Waschen Sie das 40 μm Zellsieb mit dem Medium. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis nur noch Fettgewebe im 40 μm Zellsieb übrig ist. Spülen Sie das Sieb mit 3-5 ml Medium, um die Zellrückgewinnung zu erhöhen.
5. Zentrifugieren Sie die Küvette bei 300 x g für 5 min bei RT. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und 10 ml 1x RBC-Lysepuffer zum Pellet geben. Pipettieren Sie auf und ab, lassen Sie es 2–3 Minuten bei RT und zentrifugieren Sie es dann bei 300 x g für 5 Minuten bei RT.
6. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die von roten Blutkörperchen erschöpften Splenozyten in 10 ml Medien. Bestimmen Sie die Gesamtzellzahl mit einem Hämozytometer oder einem anderen Zellzählgerät. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation wie oben beschrieben.
   HINWEIS: Die ideale Endkonzentration, die für die Indo-1-Beladung von Splenozyten erforderlich ist, beträgt 10–20 x 10⁶ Zellen/ml, es kann jedoch eine niedrigere Zellkonzentration verwendet werden.
7. Resuspendieren Sie Splenozyten bei 15 x 10⁶ Zellen/ml in Calciumflussmittel-Ladepuffer (Roswell Park Memorial Institute, RPMI1640 Medium mit 1 % FCS, 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 1 mM Magnesiumchlorid (MgCl₂), 1 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N, N,N', N'-Tetraessigsäure (EGTA) und 5 % Penicillin-Streptomycin). Fügen Sie 1,5 μM Indo-1 aus einer 1 mM DMSO-Stammlösung hinzu und drehen Sie das Röhrchen zum Mischen mehrmals um. Vor Licht schützen und die Zellen 30 Minuten lang bei 37 °C im Wasserbad inkubieren.
8. Fügen Sie nach der 30-minütigen Inkubation die 5-fache Menge an Calciumflussmittel-Ladepuffer hinzu. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 7 min bei RT.
9. Für das Gating auf B-Zellen färben Sie die Zellen mit 1:200 Anti-Maus CD5-PE und Anti-Maus 1:200 B220-PE/Cy7 in 0,5 mL Ladepuffer bei 4 °C für 20 min lichtgeschützt.
10. Die Splenozyten werden in einem Calciumflussmittel-Ladepuffer gewaschen und bei 300 x g für 7 min bei RT zentrifugiert. Die Zellen werden bei 10–20 x 10^x 10 6 Zellen/ml in einem Calciumflussmittel-Laufpuffer (Hank's balanced salt solution (HBSS) mit 1 % FCS, 1 mM MgCl₂ und 1 mM Calciumchlorid (CaCl₂)) resuspendiert. Auf Eis lichtgeschützt lagern, bis es auf dem Durchflusszytometer betriebsbereit ist.
11. Richten Sie die Durchflusszytometrie mit ungefärbten und Einzelfärbungskontrollen zur Kompensation ein.
    1. Lassen Sie die gefärbten Zellen laufen, um die Gates entsprechend einzurichten (siehe Abbildung 1A). Richten Sie das Diagramm Indo-1 (violett) versus Indo-1 (blau) ein, passen Sie die Spannungen in den Indo-1-Kanälen an, um die zu färbenden Zellen bei einer Steigung von 45–60° zu platzieren und so das Signal-Rausch-Verhältnis der Änderung des Verhältnisses von Indo-1 violett zu blau nach der B-Zell-Stimulation zu maximieren.
       HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Spannungen nicht zu hoch sind, so dass ein erheblicher Prozentsatz der Zellen (>5%) gegen den oberen Rand des Diagramms anliegt.
    2. Erstellen Sie ein diagonales Gate, das den oberen linken Teil (Violett⁺Blau^-) des Diagramms einkapselt, so dass sich ohne Stimulation <10 % der Zellen im Gate befinden, was idealerweise nach der Stimulation auf >75 % ansteigen sollte.
12. Geben Sie 0,5 ml Zellen in ein verschlossenes 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden (Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortierröhrchen (FACS)) und erwärmen Sie die Zellen 3–5 Minuten lang in einem Wasserbad auf 37 °C. Legen Sie das FACS-Rohr in die 37 °C warme, wasserummantelte Kammer, die mit einem Umlaufwasserbad verbunden ist.
    1. Führen Sie das Rohr in den Wassermantel des Durchflusszytometers und starten Sie die Erfassung, ohne die Daten zu speichern, bei ca. 5.000 bis 10.000 Ereignissen/s. Sobald sich die Zellen stabilisiert haben (15–30 s), beginnen Sie mit der Datenerfassung und sammeln Sie mindestens 10 s lang Daten, um den Hintergrund zu ermitteln.
    2. Nehmen Sie bei der 10-Rotz-Markierung schnell den Schlauch aus dem Durchflusszytometer, fügen Sie die Stimulation hinzu (5-50 μM antigene Liposomen in 2–20 μL), pulsieren Sie den Wirbel und setzen Sie den FACS-Schlauch wieder auf das Durchflusszytometer. Behalten Sie die Datenerfassung und -speicherung während dieser Zeit bei und sammeln Sie Daten für 3-5 Minuten.
13. Analysieren Sie die Daten in einer entsprechenden Analysesoftware unter den Kinetikfunktionen.

Tabelle 1: Berechnungen zur Erstellung eines Liposoms mit einer Gesamtlipidkonzentration von 1,25 μM.Beispiel für eine Berechnungstabelle für Anti-Maus-IgM F(ab)-Fragment-Liposomen von Ziegen.

kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg Uhr kg kg kg kg Uhr kg kg kg

Mw	790	387	2900	3000	Artikel-Nr.: 48000
	DSPC	Cholesterin	PEG-DSPE	Überschuss PEG-DSPE	aIgM-PEG-DSPE	gesamt
Molares Verhältnis	Nr. 57	38	3,9	1	0,1	100,00
Masse (mg)	0,56	0,18	0,14	0,04	0,06	0,98
mmol	0,71	0,47	0,05	0,01	0,00	1,25
Ml	112,50	45,93	70,64	0,00	525,97	755,03
			Konz. (mg/ml)
		DSPC	5
		Cholesterin	4
		PEG-DSPE	arabische Ziffer
		aIgM-PEG-DSPE	0,114

Ergebnisse

Abbildung 1: Repräsentative Gating-Strategie, Ergebnisse des Kalziumflusses und Analyse.(A) Die Zellen wurden mit der folgenden Gating-Strategie analysiert: lebende Lymphozyten (FSC-A vs. SSC-A), Einzelzellen (FSC-W vs. SSC-W) und B-Zellen (B220⁺CD5^-). (B) Die Indo-1/Ca2⁺-Flussantwort (violett vs. blau) d...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Modell 2110 Fraktionssammler	BioRad	7318122
Cholestrol	Sigma	Nr. C8667	Sigma-Note 99%
SPDP	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 21857
DSPC	Avanti	850365
DSPE-PEG 18:0	Avanti	Artikel-Nr.: 880120
DSPE-PEG Maleimid	Avanti	880126
extruder	Avanti	Artikel-Nr.: 610000	1mL Spritze mit Halter/Heizblock
Filter 0,1 μm	Avanti	610005
Filter 0,8 μm	Avanti	610009
10mm Filterhalterungen	Avanti	6100014
Glaskolben mit rundem Boden	Sigma	Z100633
Turnover-Stopper	Thermo Fisher Scientific	Tel. P-301398
Verrohrung	Thermo Fisher Scientific	Tel. P-198194
Leur Schloss	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: k4201634503
Sephadex G50 Perlen	GE Biowissenschaften	17004201
Sephadex G100 Perlen	GE Biowissenschaften	17006001
Hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum	Thermo Fisher Scientific	10082147
HEPES (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
EGTA (EGTA)	Sigma	Nr. E3889
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Thermo Fisher Scientific	15140122
1x Erythrozyten-Lyse-Puffer	Thermo Fisher Scientific	Tel.: 00-4333-57
Indo-1	Invitrogen	Nr. I1203
CD5-PE	BioLegende	100608
B220-PE-Cy7	BioLegende	103222
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14170112	Ohne Calcium und Magnesium
MgCl2	Sigma	M8266
CaCl2	Sigma	Nr. C4901
Fabelhaftes Anti-Maus-IgM	Jackson Immunforschung	Artikel-Nr.: 115-007-020
F(ab')2 Anti-Maus-IgM	Jackson Immunforschung	Artikel-Nr.: 115-006-020