Filtratproteinkonzentration in Bakterienkulturen mit einem Ultrafiltrationsgerät

Zusammenfassung

Quelle: Ryan, J. M., et al. Mycobacterium tuberculosis Extrazelluläre Vesikelanreicherung durch Größenausschlusschromatographie. J. Vis. Exp. (183) (2022)

Dieses Video zeigt die Isolierung und Konzentration von Bakterienkulturfiltratproteinen, zu denen auch bakterielle extrazelluläre Vesikel gehören, mittels Ultrafiltration. Die konzentrierten extrazellulären Vesikel dienen als diagnostische Marker für die Krankheitserkennung.

Protokoll

>1. Herstellung von extrazellulärem Vesikel (EV)-Konzentrat aus rohem Mycobacterium tuberculosis (Mtb)

HINWEIS: Für detaillierte Verfahren zur Kultivierung von Mtb und zur Herstellung von Kulturfiltratprotein (CFP). Es wird empfohlen, dass bakterielle Nährmedien frei von Wachstumszusätzen mit EV-haltigen oder proteinhaltigen Bestandteilen wie Ölalbumin-Dextrose-Katalase (OADC) und Detergenzien wie Tween sind. Es wird auch empfohlen, die Qualität der Bakterienkultur und das geerntete CFP zu untersuchen, um einen begrenzten Zelltod und eine begrenzte Lyse zu gewährleisten.

1. Bereiten Sie einen 100 kDa Molekulargewichts-Cut-off-Zentrifugalfilter (MWCO) vor (siehe Materialtabelle), indem Sie die volle Volumenkapazität von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) hinzufügen. 5 min bei 2.800 x g bei 4 °C zentrifugieren.
   HINWEIS: Wennich einen Filter ohne Totstoppvolumen verwende, muss darauf geachtet werden, dass das Probenvolumen nicht unter das Filterniveau sinkt, was zu einer vollständigen Filtertrocknung während der Zentrifugation führt.
2. Entsorgen Sie den Durchfluss und alle verbleibenden PBS, bevor Sie die Probenkammer bis zur maximalen Kapazität mit Mtb CFP füllen. Zentrifugieren Sie bei 2.800 x g bei 4 °C, bis das Volumen auf das Mindestvolumen des Ultrafiltrationsgeräts reduziert ist. Wiederholen Sie dies bei Bedarf und fügen Sie dem Gerät mehr CFP hinzu, bis die gesamte Probe ausreichend reduziert wurde.
   Anmerkung: Bewahren Sie bei Bedarf einen Teil des 100 kDa Durchflussmaterials (100F) für die nachgelagerte Qualifizierung auf. Bei 4 °C lagern.
3. Geben Sie 1x PBS in die Filtereinheit, die das Konzentrat enthält, bis zur Gesamtkapazität des Geräts. Reduzieren Sie die Lautstärke wie in 1.2 beschrieben. Wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal, um eine vollständige Reinigung und einen Pufferwechsel zu gewährleisten.
4. Das konzentrierte CFK-Retentat (100R) mit 100 kDa wird gemäß den Spezifikationen des Ultrafiltrationsgeräts zurückgewonnen (siehe Materialtabelle). Sobald der 100R wiederhergestellt ist, waschen Sie den Filter mindestens dreimal mit einem Mindestvolumen von 1x PBS und legen Sie den Waschgang mit dem 100R zusammen, um die Rückgewinnung zu maximieren.
5. Quantifizieren Sie das 100R-Material mit einem bicinchoninischen Assay (BCA) gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Um den Assay durchzuführen, verwenden Sie mehrere Verdünnungen von Proben 1:2, 1:5 und 1:10 in PBS. Testen Sie die Probe in dreifacher Ausfertigung.
   Anmerkung: Bewahren Sie bei Bedarf einen Teil des 100R-Materials für die nachgelagerte Qualifizierung auf. Bei 4 °C lagern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Automatischer Fraktionssammler	IZON Wissenschaft	AFC-V1-USD
Centricon Plus - 70 Zentrifugalfilter, 100 kDa Abschaltung	Millipore Sigma	UFC710008	Ultrafiltrationsvorrichtung, die in Schritt 1.1 verwendet wird
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1X ohne Calcium und Magnesium	Corning	21-040-CV
Nitrozellulose-Membran, Rolle, 0,2 μm	BioRad	1620112