>1. Zubereitung von rohem Mtb EV-Konzentrat
HINWEIS: Detaillierte Verfahren zur Kultivierung von Mtb und zur Herstellung von Kulturfiltratprotein (CFP) finden Sie unter Referenzen. Es wird empfohlen, dass bakterielle Nährmedien frei von Wachstumszusätzen mit EV-haltigen oder proteinhaltigen Bestandteilen wie Ölalbumin-Dextrose-Katalase (OADC) und Detergenzien wie Tween sind. Es wird auch empfohlen, die Qualität der Bakterienkultur und das geerntete CFP zu untersuchen, um einen begrenzten Zelltod und eine begrenzte Lyse zu gewährleisten.
- Bereiten Sie einen 100 kDa Molekulargewichts-Cut-off-Zentrifugalfilter (MWCO) vor (siehe Materialtabelle), indem Sie die volle Volumenkapazität von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) hinzufügen. 5 min bei 2.800 x g bei 4 °C zentrifugieren.
Anmerkung: Bei Verwendung eines Filters ohne Totstoppvolumen muss darauf geachtet werden, dass das Probenvolumen nicht unter das Filterniveau sinkt, was zu einer vollständigen Filtertrocknung während der Zentrifugation führt.
- Entsorgen Sie den Durchfluss und alle verbleibenden PBS, bevor Sie die Probenkammer bis zur maximalen Kapazität mit Mtb CFP füllen. Zentrifugieren Sie bei 2.800 x g bei 4 °C, bis das Volumen auf das Mindestvolumen des Ultrafiltrationsgeräts reduziert ist. Wiederholen Sie dies bei Bedarf und fügen Sie dem Gerät mehr CFP hinzu, bis die gesamte Probe ausreichend reduziert wurde.
Anmerkung: Bewahren Sie bei Bedarf einen Teil des 100 kDa Durchflussmaterials (100F) für die nachgelagerte Qualifizierung auf. Bei 4 °C lagern.
- Geben Sie 1x PBS in die Filtereinheit, die das Konzentrat enthält, bis zur Gesamtkapazität des Geräts. Reduzieren Sie die Lautstärke wie in 1.2 beschrieben. Wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal, um eine vollständige Reinigung und einen Pufferwechsel zu gewährleisten.
- Das konzentrierte CFK-Retentat (100R) mit 100 kDa wird gemäß den Spezifikationen des Ultrafiltrationsgeräts zurückgewonnen (siehe Materialtabelle). Sobald der 100R wiederhergestellt ist, waschen Sie den Filter mindestens dreimal mit einem Mindestvolumen von 1x PBS und legen Sie den Waschgang mit dem 100R zusammen, um die Rückgewinnung zu maximieren.
- Quantifizieren Sie das 100R-Material mit einem bicinchoninischen Assay (BCA) gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Um den Assay durchzuführen, verwenden Sie mehrere Verdünnungen von Proben 1:2, 1:5 und 1:10 in PBS. Testen Sie die Probe in dreifacher Ausfertigung.
Anmerkung: Bewahren Sie bei Bedarf einen Teil des 100R-Materials für die nachgelagerte Qualifizierung auf. Bei 4 °C lagern.
>2. Größenausschlusschromatographie für die Anreicherung von Mtb-EVs aus CFP
HINWEIS: Das folgende Verfahren ist spezifisch für die Verwendung von 3 mg 100R Mtb CFP mit SEC-Säule und automatischem Fraktionssammler (AFC, siehe Materialtabelle). Es kann für andere Ausgangskonzentrationen und Säulentypen angepasst werden, indem die Herstellerspezifikationen befolgt werden. Darüber hinaus wird den Benutzern empfohlen, das Benutzerhandbuch für den automatischen Fraktionssammler zu lesen und zu verstehen.
- Lassen Sie die SEC-Säule auf Raumtemperatur äquilibrieren.
- Schalten Sie die AFC mit dem Netzschalter auf der Rückseite des Turmgeräts ein und passen Sie die Einstellungen für die Wägezelle an, indem Sie bei Bedarf auf dem Touchscreen des Hauptmenüs auf SETUP drücken. Die Wägezelle darf nur bei der ersten Inbetriebnahme, nach jedem Software-Update und dann kalibriert werden, wenn eine Inkonsistenz der Fraktionssammelmengen festgestellt wird.
- Richten Sie das Karussell auf dem Bildschirm SETUP aus, indem Sie KARUSSELL > KALIBRIEREN auswählen. Setzen Sie das Karussell mit den 13 kleinen Löchern nach oben in den AFC-Turm ein und stellen Sie das Karussell durch Drücken der Tasten - und/oder + so ein, dass sich die Flüssigkeitsdüse direkt über der Spülposition befindet.
- Entfernen Sie die Kappen von der äquilibrierten SEC-Säule. Schieben Sie die SEC-Säule in die entsprechende Säulenhalterung und installieren Sie sie vorsichtig auf dem AFC-Turm. Stellen Sie sicher, dass das RFID-Etikett (Radio Frequency Identification) an der Säule zum AFC zeigt, und überprüfen Sie, ob die Verbindung zwischen der Säule und dem Ventil sicher ist. Legen Sie den Ablaufschlauch in einen Auffangbehälter.
- Wählen Sie auf dem Bildschirm SETUP die Option Entnahmezeitplan und stellen Sie die Anzahl auf 13 und die Größe auf 0,5 ml ein, indem Sie die Tasten - und/oder + drücken. Belassen Sie die Einstellung "Puffervolumen" als Standardeinstellung von 2,7 ml und schließen Sie dann das Fenster "Entnahmezeitplan", indem Sie X drücken.
- Wählen Sie auf dem Startbildschirm SAMMLUNG STARTEN und bestätigen Sie die Sammlungsparameter mit JA. Laden Sie 13 beschriftete 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geöffneten Deckeln und in Richtung Karussellmitte.
- Schieben Sie den AFC voran, indem Sie OK auswählen, montieren Sie dann den Säulenbehälter und fahren Sie erneut vor, indem Sie OK drücken. Wählen Sie die Option zum Leeren der Säule aus, indem Sie JA drücken, und fügen Sie ein Säulenvolumen mit 0,2 μm gefiltertem PBS hinzu, um den Speicherpuffer zu entfernen. Sobald die Spülung abgeschlossen ist, schalten Sie den AFC ein, indem Sie OK drücken.
- Platzieren Sie die Karussellabdeckung über dem AFC und drücken Sie OK. Bereiten Sie ein Säulenvolumen mit 0,2 μm gefiltertem PBS vor. Verwenden Sie eine Pipette, um überschüssigen Puffer von der Säule zu entfernen.
- Bringen Sie 3 mg der in Schritt 1,5 quantifizierten 100R-Probe auf 500 μl mit 1x PBS. Geben Sie die 3-mg-Probe an den oberen Rand der Säule. Schieben Sie den AFC vor und lassen Sie die Probe in die Fritte laufen. Sobald die Probe vollständig in die Säule gelangt ist, wird das in Schritt 2.6 hergestellte PBS in das Reservoir gegeben.
- Überwachen Sie den Lauf des AFC, während er zuerst das Void-Volumen und dann die angegebenen Fraktionen sammelt. Nachdem der Lauf abgeschlossen ist und das Karussell in die Abfallposition zurückkehrt, entfernen Sie die Abdeckung und entfernen Sie die Fraktionsröhrchen aus dem Karussell. Die Fraktionen werden vor der Quantifizierung (Schritt 3) und Qualifizierung (Schritt 4) bei 4 °C gelagert.
- Wenn die Spalte wiederverwendet werden soll, wählen Sie die Option zum Bereinigen der Spalte aus, indem Sie JA drücken. Andernfalls drücken Sie NEIN. Folgen Sie den Anweisungen auf der AFC.
HINWEIS: Sobald die Säule gewaschen ist und der Vorratspuffer durchlaufen ist, kann er entfernt, verschlossen und bei 4 °C gelagert werden.