Eine Technik zur Quantifizierung von Pilzinfektionen bei Zebrafischlarven

Zusammenfassung

Quelle: Thrikawala, S., et al. Infektion von Zebrafischlarven mit Aspergillus-Sporen zur Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktionen. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video zeigt eine Methode zur Quantifizierung von Pilzinfektionen bei Zebrafischlarven. Pilzsporen werden in den Ventrikel des Hinterhirns der Larve mikroinjiziert, und die Larven werden inkubiert, um die Entwicklung einer Infektion zu ermöglichen. Infizierte Larven werden in definierten Intervallen geerntet, und der Infektionsfortschritt wird durch die Aufzählung koloniebildender Einheiten bewertet.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitung von Aspergillus-Sporen für die Injektion

1. Berechnen Sie aus einer Aspergillus-Sporensuspension das Volumen, das benötigt wird, um 1 x 10⁶ Sporen zu erhalten. Das Volumen sollte 20–100 μl betragen; wenn nicht, eine 10-fache Verdünnung in 0,01 % (v/v) sterilem Tween-20 (Tween-Wasser; Tabelle der Materialien). Wenn das berechnete Volumen beispielsweise 5 μl beträgt, stellen Sie eine 10-fache Verdünn....

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dumont Pinzette #5	Roboz Chirurgisches Instrument Co.	RS-5045
Okular-Absehen	Welt des Mikroskops	RETR10	Zur Kalibrierung von Nadeln, die im Stereomikroskop verwendet werden
Mikroinjektor-Setup: Gegendruckeinheit	Angewandte wissenschaftliche Instrumente	BPU
Fußschalter	Angewandte wissenschaftliche Instrumente	FTSW
Mikro-Pipettenhalter-Kit	Angewandte wissenschaftliche Instrumente	M-Pip
Druckinjektor	Angewandte wissenschaftliche Instrumente	MPPI-3
Aufbau des Mikromanipulators: Mikromanipulator	Narashige (Tritech)	M-152
Magnetischer Ständer und Platte	Tritech	MINJ-HBMB
Nadelabzieher	Sutter-Instrument	P-97
stereomikroskop	Nikon	Nr. SMZ-745
Tissuelyser II	Qiagen	Artikel-Nr.: 85300	Zur Homogenisierung von Larven
Material
Agarose	Fischer	BP160-500
Ampicillin-Natriumsalz	Fischer	AAJ6380706
BSA, Fraktion V	VWR	AAJ65855-22
Kanamycinsulfat	Fischer	AAJ1792406
L-Streuer	Fischer	Tel.: 14 665 230
Mikrokapillarnadeln (kein Filament)	World Precision Instruments (WPI)	TW100-3
Microloader-Pipettenspitzen	VWR	89009-310	Um die Nadel mit Aspergillus-Suspension zu belasten
Miracloth	VWR	EM475855-1R	Zur Filterung der Aspergillus-Suspension
N-Phenylthioharnstoff	Fischer	AAL0669009	Um Pigmentflecken vorzubeugen
Phenolrot, 1%ige Lösung	Fischer	Artikel-Nr.: 57254
Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat, Methansulfonsäuresalz)	Fischer	AC118000500	Um Larven zu betäuben
Tween-20	Fischer	Nr. BP337-500
Medien und Lösungen			Komponenten/Rezeptur
E3-Medien: 60x E3			17,2 g NaCl, 0,76 g KCl, 2,9 g CaCl2, 4,9 g MgSO4 · 7H2O, bis 1 L mit H2O
1x E3			16,7 ml 60x Schaft, 430 ul 0,05 M NaOH, auf 1 L mit H2O (optional: + 3 ml 0,01% Methylenblau)
Tricain-Stammlösung			2 g Tricain, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4,2 ml 60X E3, bis 500 ml mit H2O, pH bis 7,0-7,5 mit NaOH
Glukose-Minimalmedium-Agar (GMM): GMM-Agar			10 g Glukose (Dextrose), 50 ml 20x Nitratsalze, 1 ml TE, auf 1 L mit H2O, pH bis 6,5 mit NaOH, + 16 g Agar, Autoklav
20x Nitratsalze			120 g NaNO3, 10,4 g KCl, 10,4 g, MgSO4 · 7H2O, 30,4 g, KH2PO4, bis 1 L mit H2O, autoklav
Spurenelemente (TE)			2,20 g ZnSO4 · 7H2O, 1,10 g H3BO3, 0,50 g MnCl2 · 4H2O, 0,16 g FeSO4 · 7H2O, 0,16 g CoCl2 · 6H2O, 0,16 g CuSO4 · 5H2O, 0,11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5,00 g Na2EDTA, auf 100 ml mit H2O, unter Rühren über Nacht auflösen, autoklavieren