Eine zWEDGI-Technik zur Visualisierung von mit Pilzerregern infizierten Zebrafischlarven

Zusammenfassung

Quelle: Thrikawala, S. et al., Infektion von Zebrafischlarven mit Aspergillus-Sporen zur Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktionen.J. Vis. Exp.(2020)

Das Video demonstriert eine Technik zum Verletzen und Einfangen von Zebrafischen zur Beobachtung von fluoreszenzmarkierten Pilzerregerinfektionen in Zebrafischlarven. Die Erstinfektion zieht Makrophagen an, und wenn die Infektion anhält, schreitet die Rekrutierung von Neutrophilen an der Injektionsstelle fort.

Protokoll

>1. Vorbereitung von Aspergillus-Sporen für die Injektion

1. Berechnen Sie aus einer Aspergillus-Sporensuspension das Volumen, das benötigt wird, um 1 x 10⁶ Sporen zu erhalten. Das Volumen sollte 20–100 μl betragen; wenn nicht, eine 10-fache Verdünnung in 0,01 % (v/v) sterilem Tween-20 (Tween-Wasser; Tabelle der Materialien). Wenn das berechnete Volumen beispielsweise 5 μl beträgt, stellen Sie eine 10-fache Verdünnung her und verwenden Sie 50 μl der verdünnten Lösung.
   Anmerkung: Es können zwei Platten/Stämme vorbereitet werden, um weitere Sporen zu sammeln oder als Ersatz im Falle einer Kontamination.
2. Verteilen Sie 1 x 10⁶ Aspergillus-Sporen auf einer Platte mit Glukose-Minimalmedium (GMM) (Table of Materials) mit einem sterilen L-förmigen Einweg-Spreader in einer Biosicherheitswerkbank. Vermeiden Sie es, sich auf den Rand der Platte auszubreiten. Inkubieren Sie 3–4 Tage lang bei 37 °C mit der Platte nach unten.
3. Bringen Sie am Tag der Entnahme steriles Miracloth und konische 50-ml-Röhrchen (zwei pro Stamm), frische Flaschen mit sterilem Tween-Wasser (eine pro Stamm) und sterile L-förmige Einweg-Spreader zur Biosicherheitswerkbank.
   Anmerkung: Miracloth kann in ~8 Zoll x 6 Stücke geschnitten, in Folie eingewickelt und zum Sterilisieren autoklaviert werden.
4. Legen Sie ein Stück Miracloth in jedes beschriftete konische 50-ml-Röhrchen und verschließen Sie es wieder. Nehmen Sie das restliche Miracloth-Päckchen aus der Haube.
5. Bringen Sie die Platten in die Biosicherheitswerkbank. Öffne einen Teller und gieße dann Tween-Wasser auf die Oberseite, so dass etwa drei Viertel des Tellers bedeckt sind.
6. Kratzen Sie mit einem L-förmigen Einweg-Spreizer vorsichtig die Oberfläche der Pilzkultur in einer Hin- und Herbewegung ab, während Sie mit der anderen Hand die Platte drehen. Kratzen, bis fast alle Sporen im Tween-Wasser homogenisiert sind.
   Anmerkung: Aufgrund der hohen Hydrophobie können Sporen "Puffs" erzeugen, wenn Tween-Wasser hinzugefügt wird oder während des Schabens. Es sollte große Sorgfalt darauf verwendet werden, eine Kontamination von nahe gelegenen Rohren oder Platten zu vermeiden. Es wird empfohlen, die Handschuhe zu wechseln und die Oberfläche zwischen der Extraktion verschiedener Stämme mit 70% Ethanol abzuwischen.
7. Nehmen Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen und entfernen Sie das Stück Miracloth. Falten Sie es in der Mitte und machen Sie es zu einem Filter, der oben in das konische 50-ml-Röhrchen eingesetzt wird.
8. Gießen Sie das Pilzhomogenat von der Platte über das Miratuch in die Tube.
   Anmerkung: Wenn zwei Platten eines Stammes vorbereitet sind, kratzen Sie beide Platten ab und gießen Sie sie in dasselbe konische Rohr.
9. Gießen Sie Tween-Wasser ein, um das Gesamtvolumen im konischen Röhrchen auf 50 mL zu bringen.
10. Bei 900 x g 10 min schleudern und darauf achten, dass in der Zentrifuge Verschlüsse verwendet werden, die die Aerosolisierung verhindern.
11. Gießen Sie den Überstand in ~10%ige Bleichlösung, um ihn zu dekontaminieren. Gießen Sie 50 ml sterile 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in das konische Röhrchen, dann vortexen oder schütteln, um das Pellet wieder zu suspendieren.
12. Nochmals bei 900 x g für 10 min schleudern. Den Überstand abgießen und das Pellet in 5 mL sterilem 1x PBS resuspendieren. Durch ein frisches Stück Miracloth in ein frisches konisches 50-ml-Röhrchen filtrieren.
13. Führen Sie 10-fache serielle Verdünnungen (10x, 100x, 1000x) des Pilzhomogenats in 1,7 mL-Zentrifugenröhrchen durch (z. B. für die 10x-Lösung mischen Sie 100 μL des Pilzhomogenats mit 900 μL Tween-Wasser).
14. Wählen Sie die erste Verdünnung, in der die Sporen nicht sichtbar sind, wenn es in das Tween-Wasser abgegeben wird, und verwenden Sie diese Verdünnung, um die Anzahl der Sporen mit einem Hämozytometer zu zählen.
15. Berechnen Sie die Sporenkonzentration in dem vorbereiteten Pilzhomogenat (Wassersuspension) nach folgender Formel:
    Konzentration (Sporen/ml) = Anzahl der Sporen in den mittleren 25 Kästen x Verdünnungsfaktor x 10⁴
16. Bereiten Sie einen 1-ml-Stamm von 1,5 x 10⁸ Sporen/ml in sterilem 1x PBS in einem 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Dieses Sporenpräparat kann bei 4 °C für ~4 Wochen gelagert werden.
17. Mischen Sie vor der Verwendung in Injektionen 20 μl des Sporenpräparats mit 10 μl 1 % sterilem Phenolrot in einem 1,7 mL Zentrifugenröhrchen, um eine endgültige Sporenkonzentration von 1 x 10⁸ Sporen/ml zu erreichen. Vor der Injektion gründlich vortexen.
    HINWEIS: 1%ige Phenolrotlösung sollte filträchtig sterilisiert und in Aliquoten gelagert werden.
18. Für eine Scheininjektion mischen Sie 20 μl 1x PBS mit 10 μl 1% sterilem Phenolrot.

>2. Vorbereitung von Agarplatten für die Injektion

1. 2% Agarose in E3-Medium zubereiten und in der Mikrowelle schmelzen.
2. In eine 100 mm x 15 mm große Petrischale (~25 mL pro Platte) geben, schwenken, um die Platte gleichmäßig zu bedecken, und abkühlen lassen.
3. Die Platte mit Paraffinfolie umwickeln und umgedreht bei 4 °C lagern.
4. Bringen Sie die Platte vor der Injektion auf Raumtemperatur (RT).
5. Gießen Sie ~1 ml filtersterilisiertes 2%iges Rinderserumalbumin (BSA) auf die Platte, kippen Sie die Platte, um sie zu verteilen und den gesamten Boden zu bedecken, und spülen Sie sie mit E3.
   HINWEIS: Die 2%ige BSA-Lösung kann filtriert und als 1 ml-Aliquote bei -20 °C gelagert werden. Die 2%ige BSA-Vorbehandlung verhindert, dass die Larven an der Oberfläche der Agarose haften bleiben.
6. Gießen Sie E3 mit gepuffertem Tricain auf den Teller und lassen Sie es bis zur Injektion ruhen.

>3. Mikroinjektion von Zebrafischlarven im Hinterhirn

1. Larven mit einer Pinzette bei 2 dpf in einer Petrischale manuell dechorionieren.
   Anmerkung: Die Dechorionierung kann jederzeit ab 1,5 dpf bis zum Zeitpunkt der Injektion durchgeführt werden.
2. Entfernen Sie so viel E3 wie möglich aus der Petrischale und fügen Sie gepuffertes 300 μg/ml Tricain in E3 hinzu, um die Larven zu betäuben.
   Anmerkung: Eine Stammlösung aus gepuffertem 4 mg/ml Tricain in E3 kann hergestellt und bei 4 °C gelagert werden. Die Arbeitslösung kann durch Verdünnen von 4 mL der Stammlösung auf bis zu 50 mL mit E3 hergestellt werden.
3. Verwenden Sie eine Mikroinjektionsanlage, die mit dem Druckinjektor, der Gegendruckeinheit, dem Fußschalter, dem Mikropipettenhalter, dem Mikromanipulator sowie einem magnetischen Ständer und einer Magnetplatte geliefert wird, die alle an eine Druckluftquelle angeschlossen sind (Materialtabelle).
4. Öffnen Sie das Druckluftventil und schalten Sie den Mikroinjektor ein. Stellen Sie den Druck auf ~25 PSI, die Impulsdauer auf 60 ms und die Gegendruckeinheit auf 1 Pfund pro Quadratzoll (PSI) ein.
5. Laden Sie eine Mikroinjektionsnadel mit einer Microloader-Pipettenspitze (Materialtabelle) mit ca. 3–5 μl vorbereitetem PBS oder Sporensuspension mit Phenolrot. Montieren Sie die Nadel auf den Mikromanipulator.
   Anmerkung: Mikroinjektionsnadeln können wie zuvor beschrieben vorbereitet werden. Das Stereomikroskop, das für Mikroinjektionen verwendet wird, sollte über ein Okularabsehen verfügen, um die Mikroinjektionsnadel zu kalibrieren. Das Absehen sollte mit einem Tischmikrometer kalibriert und die Länge der Absehenskala (μm) bestimmt werden. Der Durchmesser des Tropfens der Sporensuspension, der aus der Nadel ausgestoßen wird, wird in Abhängigkeit von der Anzahl der Hashes (des Absehens) gemessen, die sich mit dem Tropfen überlappen.
6. Positionieren Sie den Mikromanipulator so, dass das Ende der Nadel bei der geringsten Vergrößerung unter dem Stereomikroskop sichtbar ist. Zoomen Sie auf 4-fache Vergrößerung, wobei Sie die Nadel im Blick behalten.
7. Schneiden Sie mit einer scharfen Pinzette das Ende der Nadel ab. Drücken Sie das Einspritzpedal, um die Größe des austretenden Tröpfchens zu visualisieren. Schneiden Sie so lange zurück, bis ~3 nL Sporensuspension injiziert werden (hier sind dies fünf Hashes).
8. Schieben Sie den Mikromanipulator und die Nadel aus dem Weg, um ein versehentliches Anschlagen der Nadel zu vermeiden, während die Larven auf der Injektionsplatte angeordnet sind.
9. Gießen Sie E3-Tricain aus der Injektionsplatte, dann übertragen Sie ~24 betäubte Larven mit so wenig E3 wie möglich mit einer Transferpipette auf die Injektionsplatte.
10. Ordnen Sie die Larven mit einem kleinen Werkzeug zur Manipulation von Zebrafischlarven (z. B. Haarschlingenwerkzeug oder Wimpernwerkzeug) entsprechend der Richtung an, in die sie zeigen. Platzieren Sie insbesondere alle nach rechts gerichteten Elemente in einer Reihe und alle nach links gerichteten Elementen in einer Reihe darunter.
    Anmerkung: Diese Anordnung ist schwierig, wenn sich zu viel Flüssigkeit auf der Platte befindet, da die Larven dann an ihrem Platz "schwimmen". Problematisch ist aber auch zu wenig Flüssigkeit, wenn die Injektionen lange dauern, da die Larven austrocknen können oder die Narkose nachlässt. Daher sollte während des gesamten Mikroinjektionsprozesses sorgfältig auf die Flüssigkeitsmenge auf der Platte geachtet werden.
11. Stellen Sie den Zoom des Mikroskops auf die niedrigste Vergrößerung ein. Bringen Sie den Mikromanipulator zurück und ordnen Sie ihn so an, dass sich die Nadel in einem Winkel von ~30°–60° in der Mitte des Sichtfeldes in der Nähe der Larven befindet.
12. Vergrößern Sie die Kamera auf die höchste Vergrößerung und verwenden Sie die Feineinstellknöpfe, um die Position der Nadel weiter einzustellen. Stellen Sie sicher, dass ~30–70 Sporen aus der Nadel kommen, indem Sie die Sporensuspension in die Flüssigkeit auf der Platte neben den Larven injizieren. Passen Sie bei Bedarf die Zeit und den Druck an der Injektionseinrichtung an.
    Anmerkung: Dieser Test sollte alle fünf bis sechs Larven wiederholt werden, da die Anzahl der Sporen, die aus der Nadel kommen, mit der Zeit zunehmen oder abnehmen kann.
13. Beginnend mit der Reihe, in der die Larven zur Nadel zeigen, bewegen Sie die Platte so, dass sich die Nadel direkt über und in der Nähe der ersten Larven befindet.
14. Bewegen Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator und führen Sie die Nadel durch das Gewebe um das Vesikel oticus herum, um in den Hinterhirnventrikel einzustechen. Bewegen Sie die Platte mit der anderen Hand nach Bedarf, um die richtige Ausrichtung der Larve mit dem Winkel der Nadel zu erhalten.
15. Vergewissern Sie sich visuell, dass sich das Ende der Nadel in der Mitte des Hinterhirnventrikels befindet, drücken Sie das Fußpedal, um Sporen zu injizieren, und ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück.
    Anmerkung: Der Farbstoff Phenolrot sollte in erster Linie in der Hinterhirnkammer verbleiben. Eine kleine Menge kann in das Mittelhirn gelangen, sollte aber nicht das Vorderhirn oder außerhalb des Gehirns erreichen. Wenn dies der Fall ist, ist das zu injizierende Volumen zu groß, und der Druck und die Zeit sollten entsprechend verringert oder eine neue Nadel kalibriert werden.
16. Bewegen Sie sich auf der Platte nach unten und injizieren Sie alle Larven in dieser Reihe. Drehen Sie dann die Platte um und injizieren Sie alle Larven in die andere Reihe.
    Anmerkung: Erfolglos injizierte oder versehentlich beschädigte Larven können markiert werden, indem man 1) ein paar Mal in das Eigelb injiziert, um eine rote Markierung zu erzeugen, oder 2) die Larve mit der Nadel aus der Reihe zieht.
17. Bewegen Sie die Nadel nach oben und wieder aus dem Weg. Verkleinern Sie das Mikroskop auf eine niedrigere Vergrößerung. Der Farbstoff Phenolrot sollte im Hinterhirn jeder Larve noch sichtbar sein.
18. Ziehen Sie zuerst mit einem Haarschlingenwerkzeug ab und pipettieren Sie nach oben, um alle Larven mit erfolglosen Injektionen zu entsorgen. Übertragen Sie die restlichen Larven in eine neue Petrischale, indem Sie sie mit frischem sterilem E3 und einer Transferpipette von der Platte abwaschen.
19. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, bis die endgültige Anzahl der experimentellen Proben erreicht ist.
20. Spülen Sie die Larven mindestens 2x mit E3 und stellen Sie sicher, dass sie sich von der Narkose erholen.
21. Um das Überleben ohne weitere Behandlung zu quantifizieren, übertragen Sie die Larven mit einer Transferpipette in eine 96-Well-Platte (1 Larve pro Well) in E3.

>4. Ermittlung der Anzahl der injizierten und lebensfähigen Sporen

1. Unmittelbar nach der Injektion werden mit einer Transferpipette nach dem Zufallsprinzip etwa acht der injizierten Larven entnommen und in 1,7-ml-Zentrifugenröhrchen (eine Larve pro Röhrchen) überführt.
2. Euthanasieren Sie die Larven mit Tricain oder indem Sie sie 0,5–2,0 h lang bei 4 °C halten.
3. Bereiten Sie 1 ml 1 mg/ml Ampicillin und 0,5 mg/ml Kanamycin-Antibiotikalösungen in sterilem 1x PBS vor. Die übrig gebliebene Lösung kann bei 4 °C gelagert und später verwendet werden.
   Anmerkung: Stammlösungen von Ampicillin mit 100 mg/ml und Kanamycin mit 50 mg/ml können vorgefertigt, filtriert und in Aliquoten bei -20 °C gelagert werden. Diese werden 100x in 1x PBS verdünnt, um die Arbeitslösung zu erhalten.
4. Entfernen Sie mit einer Pipette so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Zentrifugenröhrchen, lassen Sie die Larve zurück und fügen Sie 90 μL des 1x PBS mit Antibiotika hinzu.
   Anmerkung: Antibiotika werden eingesetzt, um das Bakterienwachstum in GMM-Platten zu verhindern, das die Zählung von Aspergillus-Kolonien beeinträchtigen kann.
5. Homogenisieren Sie die Larven in einem Gewebelyser bei 1.800 Oszillationen/min (30 Hz) für 6 min. Schleudern Sie bei 17.000 x g für 30 s herunter.
6. Etikettieren Sie GMM-Platten (eine Platte pro homogenisierter Larve). Verwenden Sie einen Bunsenbrenner, um eine sterile Umgebung zu schaffen, pipettieren Sie die homogenisierte Suspension von einem Röhrchen in die Mitte der GMM-Platte und verteilen Sie sie dann mit einem L-förmigen Einweg-Spreizer. Vermeiden Sie es, das Homogenat auf dem Rand zu verteilen.
7. Inkubieren Sie die Platten kopfüber bei 37 °C für 2-3 Tage und zählen Sie die Anzahl der gebildeten Kolonien, koloniebildende Einheit (KBE).
8. Um die Anzahl der während der Infektionsphase lebenden Sporen zu messen, entnehmen Sie die Larven 1–7 Tage nach der Injektion (dpi) von den 96-Well-Platten und geben Sie sie in Zentrifugenröhrchen. Euthanasieren und homogenisieren Sie die Larven, um sich auf GMM-Platten auszubreiten, wie in den Schritten 4.1–4.5 beschrieben.

>5. Medikamentöse Behandlung von injizierten Larven

1. Nach Abschnitt 4 werden die verbleibenden injizierten Larven in zwei 3,5-mm-Schalen aufgeteilt: eine für die medikamentöse Behandlung und eine für die Kontrolle. Verwenden Sie etwa 24 infizierte Larven pro Zustand.
   Anmerkung: Das 3,5-mm-Geschirr kann mit 2 % fettfreier Trockenmilch in Wasser behandelt, gespült, luftgetrocknet und zuvor bei RT gelagert werden. Das Eincremen mit Milch verhindert, dass die Larven am Kunststoff haften bleiben.
2. Die gewünschte Arzneilösung und das Vehikel in E3 ohne Methylenblau in konischen Röhrchen entsprechend der erforderlichen Endkonzentration zubereiten und gut mischen. Um beispielsweise das Überleben von Larven zu überwachen, die Dexamethason ausgesetzt sind, verwenden Sie 24 Larven (Replikate) für Dexamethason und 24 für die Vehikelkontrolle, wie z. B. Dimethylsulfoxid (DMSO). Bereiten Sie 5 ml der Arzneimittellösung in der erforderlichen Konzentration vor. Hier wurden 5 ml 0,1 % DMSO und 10 μM Dexamethason verwendet, und 24 Larven/Zustand wurden auf ~200 μl des Vehikels/der Arzneimittellösung/der Larven übertragen.
3. Mit einer Transferpipette so viel Flüssigkeit wie möglich aus einer Schale entnehmen und vorgemischtes E3 mit Fahrzeugsteuerung hinzufügen. Wiederholen Sie den Vorgang mit vorgemischtem E3, das die Behandlung enthält, die für das andere Gericht von Interesse ist.
4. Übertragen Sie die Larven mit einer Pipette in eine 96-Well-Platte (eine Larve pro Well). Überwachen Sie das Überleben von injizierten Larven, die dem Vehikel oder dem Arzneimittel ausgesetzt waren, 7 Tage lang.
   Anmerkung: Das Medikament kann nur am Tag der Infektion angewendet und während des gesamten Experiments auf den Larven aufbewahrt oder täglich aufgefrischt werden.

>6. Tägliche Bildgebung infizierter Larven mit dem Zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging (zWEDGI)

1. Es wird sichergestellt, dass die Larven mit 100 μM N-Phenylthiharnstoff (PTU) bei 24 hpf behandelt werden, um eine Pigmentierung zu verhindern, und dass PTU während des gesamten Experiments auf den Larven verbleibt.
   Anmerkung: PTU bei 75–100 μM verhindert die Pigmentierung der Larven ohne grobe Entwicklungsstörungen. PTU kann jedoch in einige biologische Prozesse eingreifen, und Forscher sollten im Voraus feststellen, ob das Medikament die untersuchten Prozesse beeinflussen kann.
2. Transgene Larven mit markierten Zellpopulationen von Interesse bei 2 dpf mit Aspergillus-Sporen infizieren, die so verändert wurden, dass sie ein fluoreszierendes Protein exprimieren, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Übertragen Sie dann infizierte Larven in Vertiefungen mit einer 48-Well-Platte in etwa 500 μl/Vertiefung E3 ohne Methylenblau.
   Anmerkung: Hier wird eine 48-Well-Platte verwendet, da es einfacher ist, Larven bei wiederholter täglicher Bildgebung hinein- und herauszuübertragen.
3. Bereiten Sie am Tag der Bildgebung zwei 3,5-mm-Petrischalen vor: eine mit 100 μM PTU und eine mit E3-Tricain.
4. Geben Sie E3-Tricain in die Kammern eines zWEDGI-Geräts. Entfernen Sie unter dem Stereomikroskop mit einer P100-Mikropipette Luftblasen aus den Kammern und dem Rückhaltekanal. Entfernen Sie alles überschüssige E3-Tricain, so dass es nur in den Kammern ist.
5. Pipettieren Sie eine Larve mit einer Transferpipette aus der Platte. Wenn viel Flüssigkeit verwendet wird, um es zu entfernen, pipettieren Sie es in eine 3,5-mm-Schale, die E3-PTU enthält. Dann wieder mit so wenig Flüssigkeit wie möglich nach oben pipettieren und in E3-Tricain umfüllen.
6. Warten Sie ~30 s für die Anästhesie, dann in die Ladekammer der Verwundungs- und Einklemmvorrichtung (z. B. zWEDGI) übertragen.
7. Positionieren Sie die Larve unter dem Stereomikroskop. Verwenden Sie die P100-Mikropipette, um E3-Tricain aus der Verwundungskammer zu entfernen und in die Ladekammer freizusetzen, um den Schwanz der Larve in den Restriktionskanal zu bewegen. Stellen Sie sicher, dass die Larve auf ihrer lateralen, dorsalen oder dorsolateralen Seite positioniert ist, damit das Hinterhirn mit einer umgekehrten Objektivlinse abgebildet werden kann.
8. Nehmen Sie die Larve mit einem konfokalen Mikroskop ab.
9. Nach der Bildgebung wird mit der P100-Pipette E3-Tricain in die Verwundungskammer freigesetzt, um die Larve aus dem Rückhaltekanal in die Ladekammer zu drücken.
10. Nehmen Sie die Larve mit einer Transferpipette auf und geben Sie sie mit E3-Tricain zurück in die Petrischale. Mit so wenig Flüssigkeit wie möglich mit E3-PTU in die Petrischale umfüllen. Spülen Sie in PTU und übertragen Sie es zurück in die 48-Well-Platte.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dumont Pinzette #5	Roboz Chirurgisches Instrument Co.	RS-5045
Okular-Absehen	Welt des Mikroskops	RETR10	Zur Kalibrierung von Nadeln, die im Stereomikroskop verwendet werden
Mikroinjektor-Setup: Gegendruckeinheit	Angewandte wissenschaftliche Instrumente	BPU
Fußschalter	Angewandte wissenschaftliche Instrumente	FTSW
Mikro-Pipettenhalter-Kit	Angewandte wissenschaftliche Instrumente	M-Pip
Druckinjektor	Angewandte wissenschaftliche Instrumente	MPPI-3
Aufbau des Mikromanipulators: Mikromanipulator	Narashige (Tritech)	M-152
Magnetischer Ständer und Platte	Tritech	MINJ-HBMB
Nadelabzieher	Sutter-Instrument	P-97
stereomikroskop	Nikon	Nr. SMZ-745
Tissuelyser II	Qiagen	Artikel-Nr.: 85300	Zur Homogenisierung von Larven
Material
Agarose	Fischer	BP160-500
Ampicillin-Natriumsalz	Fischer	AAJ6380706
BSA, Fraktion V	VWR	AAJ65855-22
Kanamycinsulfat	Fischer	AAJ1792406
L-Streuer	Fischer	Tel.: 14 665 230
Mikrokapillarnadeln (kein Filament)	World Precision Instruments (WPI)	TW100-3
Microloader-Pipettenspitzen	VWR	89009-310	Um die Nadel mit Aspergillus-Suspension zu belasten
Miracloth	VWR	EM475855-1R	Zur Filterung der Aspergillus-Suspension
N-Phenylthioharnstoff	Fischer	AAL0669009	Um Pigmentflecken vorzubeugen
Phenolrot, 1%ige Lösung	Fischer	Artikel-Nr.: 57254
Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat, Methansulfonsäuresalz)	Fischer	AC118000500	Um Larven zu betäuben
Tween-20	Fischer	Nr. BP337-500
Medien und Lösungen			Komponenten/Rezeptur
E3-Medien: 60x E3			17,2 g NaCl, 0,76 g KCl, 2,9 g CaCl2, 4,9 g MgSO4 · 7H2O, auf 1 l mit H2O
1x E3			16,7 ml 60x Schaft, 430 ul 0,05 M NaOH, auf 1 L mit H2O (optional: + 3 ml 0,01% Methylenblau)
Tricain-Stammlösung			2 g Tricain, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4,2 ml 60X E3, bis 500 ml mit H2O, pH bis 7,0-7,5 mit NaOH
Glukose-Minimalmedium-Agar (GMM): GMM-Agar			10 g Glukose (Dextrose), 50 ml 20x Nitratsalze, 1 ml TE, auf 1 L mit H2O, pH bis 6,5 mit NaOH, + 16 g Agar, Autoklav
20x Nitratsalze			120 g NaNO3, 10,4 g KCl, 10,4 g, MgSO4 · 7H2O, 30,4 g, KH2PO4, bis 1 L mit H2O, Autoklav
Spurenelemente (TE)			2,20 g ZnSO4 · 7H2O, 1,10 g H3BO3, 0,50 g MnCl2 · 4H2O, 0,16 g FeSO4 · 7H2O, 0,16 g CoCl2 · 6H2O, 0,16 g CuSO4 · 5H2O, 0,11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5,00 g Na2EDTA, auf 100 ml mit H2O, unter Rühren auflösen, autoklav