Die Photokonversionstechnik zur Erforschung der Dynamik von Entzündungszellen in Insektenpuppen

Abstract

Quelle: Weavers, H. et al., Langzeit-In-vivo-Tracking der inflammatorischen Zelldynamik in Drosophila-Puppen. J. Vis. Exp. (2018)

Das Video demonstriert die Verwendung von Photokonversion zur Untersuchung der Entzündungszelldynamik in Drosophila-Puppen. Grüne Hämozyten werden vom verwundeten Epithel angezogen, gefolgt von einer Fernwanderung. Die Photokonversion verschiebt bestimmte Hämozyten von grün nach rot, was ihre Bewegungsverfolgung erleichtert.

Protocol

Dieses Protokoll besteht aus vier aufeinanderfolgenden Hauptschritten: (1) Vorbereitung der Drosophila-Brühen und Staging der Drosophila-Puppen, (2) Puppendissektion und -montage, (3) Puppenverletzung, (4) konfokale In-vivo-Zeitraffer-Bildgebung.

>1. Vorbereitung von Drosophila-Beständen und Staging von Puppen

1. Besorgen Sie sich geeignete Drosophila-Bestände (siehe Einleitung und Materialtabelle).
2. Sammeln Sie junge, gesunde, erwachsene Fliegen des entsprechenden Genotyps.
   1. Wählen Sie erwachsene Fliegen aus, indem Sie Kohlendioxid-Gaspads verwenden, um die Fliegen kurz zu betäuben, und einen feinen Pinsel, um Fliegen des entsprechenden Genotyps oder Geschlechts in ein Sammelfläschchen zu übertragen.
   2. 20 jungfräuliche Weibchen und 20 Männchen in jedes Fläschchen geben, das Standard-Fliegenfuttermedium (eine Mischung aus Maismehl-Melasse-Agar, siehe Materialtabelle) enthält, ergänzt mit Hefe.
3. Für eine optimale Puppenbildung kippen Sie die erwachsenen Fliegen jeden Tag auf neues Futter in frischen Fläschchen und halten Sie alle Fläschchen bei 25 °C.
   Anmerkung: Wenn das Gal4-Upstream-Aktivierungssequenz-System (Gal4-UAS) verwendet wird, um die linienspezifische Genexpression zu steuern, sollten alle Schritte bei 25 °C oder höher durchgeführt werden, da das Gal4-UAS-System temperaturempfindlich ist.
4. 18 Stunden vor der geplanten Bildgebungssitzung mindestens 10 neu gebildete weiße Vorpuppen (Abbildung 1A) aus den Fläschchen auswählen (d. h. 0 h nach der Pupariumbildung, APF), indem Sie mit einer Pinzette oder einem feinen Pinsel die Puppen von der inneren Oberfläche des Fläschchens lösen und die Puppen vorsichtig an die Seite eines sauberen, leeren Plastikfläschchens legen
   Anmerkung: Wandernde Larven des 3^. Stadiums kriechen nach oben aus dem Nahrungsmedium, um sich zu verpuppen; Neu gebildete weiße Vorpuppen sind leicht zu identifizieren, da sie umgestülpte vordere Spiraceln besitzen und stationär sind (im Gegensatz zu Larven des 3^. Stadiums). Die Kutikula verwandelt sich in das "Puparium" (die Puppenhülle), das zunächst weich und weiß ist. Es muss darauf geachtet werden, dass die Puppen nicht beschädigt werden, da dies nicht nur zu einer unerwünschten, verletzungsinduzierten Entzündungsreaktion, sondern auch zu einer deutlichen Entwicklungsverzögerung führen kann.
5. Die ausgewählten Puppen werden in der Durchstechflasche bei 25 °C auf das entsprechende Entwicklungsstadium (18 h APF liefert optimale Ergebnisse) gealtert.
   Anmerkung: Mit der Entwicklung der Puppen wird die Puppenhülle zunehmend dunkler und spröder.
6. Bereiten Sie andere Reagenzien für den nächsten Schritt im Voraus vor. Um den Heptankleber herzustellen, kombinieren Sie ein 20 cm langes aufgerolltes doppelseitiges Klebeband mit 20 mL Heptan in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen, versiegeln Sie es mit der Paraffinfolie und wiegen Sie es bei Raumtemperatur über Nacht auf der Bank.

>2. Vorbereitung und Sektion von Drosophila-Puppen

1. Übertragen Sie die inszenierten Drosophila-Puppen auf ein Stück doppelseitiges Klebeband, das auf einem Objektträger befestigt ist. Positionieren Sie die Puppen so, dass die ventrale Seite fest mit dem Band verbunden ist und die dorsale Seite nach oben zeigt (Abbildung 1B).
   Anmerkung: Der vordere Teil der Puppe ist an den beiden Spirakeln zu erkennen, die aus dem vorderen Ende der Puppenhülle herausragen.
2. Entfernen Sie die Puppen vorsichtig unter einem Hellfeld-Dissektionsmikroskop mit einer Pinzette und einer Mikroschere aus ihrer schützenden Puppenhülle (Abbildung 1B-D).
   1. Machen Sie zunächst mit der Pinzette einen Schnitt im vordersten Bereich des Puppenblattes (Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, dass die Puppenhülle in diesem Bereich hohl und frei von Puppengewebe ist, da die Puppen während der frühen Puppenentwicklung innerhalb der Hülle geschrumpft sind.
   2. Nach diesem ersten Schnitt wird die Puppenhülle vorsichtig mit einer Pinzette oder Mikroschere von vorne nach hinten aufgerissen oder aufgeschnitten (Abbildung 1C), bis die Puppe vollständig von der braunen, undurchsichtigen, spröden Hülle befreit ist (Abbildung 1D).
      Anmerkung: Puppen sind in diesem Stadium sehr zerbrechlich und es muss darauf geachtet werden, dass die Puppenoberfläche nicht durchstochen wird. Eine Punktion ist offensichtlich, da die Hämolymphe schnell aus der Einstichstelle austritt. Puppen mit Einstichen, wie klein sie auch sein mögen, sollten entsorgt werden.
3. Setze die Puppen mit Heptankleber in eine Schale mit Glasboden.
   1. Geben Sie mit einer 20-ml-Pipettenspitze einen 10-ml-Tropfen vorbereiteten Heptankleber (siehe Abschnitt 1.6 oben) in eine Linie auf die Glasbodenschale.
   2. Lassen Sie den Kleber 5 s trocknen, bevor Sie die präparierten Puppen vorsichtig mit einer Pinzette auf den Heptankleber übertragen (Abbildung 1E).
   3. Um die Verwundung und Bildgebung zu erleichtern, stellen Sie die Puppen in einer Reihe auf; es werden etwa 5 Puppen empfohlen, aber mehr werden mit Erfahrung zu bewältigen sein.
      Anmerkung: Die Verwendung von Heptankleber wird bei der Verwendung von aufrechten Bildgebungssystemen empfohlen, ist jedoch bei Verwendung eines invertierten Systems nicht erforderlich. Wenn der Kleber während der Bildgebung optische Aberrationen erzeugt, können Puppen stattdessen direkt auf das Deckglas gelegt werden – die natürliche Haftung zwischen Puppengewebe und Glas wird in den meisten Fällen für eine stabile Bildgebung ausreichen, solange beim Bewegen der Bildgebungsschale zwischen den Mikroskopen Vorsicht walten gelassen wird.
4. Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie die Puppen so montieren, dass der Flügel flach auf dem Deckglas liegt und der größte Teil der Flügeloberfläche in direktem Kontakt mit dem Deckglas steht (Abbildung 1F). Rollen Sie die Puppen mit einer Pinzette, um ihre Position zu verändern und sicherzustellen, dass der Flügel richtig montiert ist.
5. Um eine Austrocknung der Probe während der Bildgebung zu verhindern, legen Sie am Ende der Montage ein in destilliertem Wasser getränktes Stück saugfähiges Filterpapier an die Seite der Glasbodenschale und achten Sie darauf, die Puppen nicht zu stören (Abbildung 1E). Decken Sie die Schüssel mit einem Deckel ab.
   Anmerkung: Die Puppen sind nun bereit für die Verwundung und Bildgebung.

>3. Laserinduzierte Verwundung von Drosophila-Puppenflügeln

1. Übertragen Sie die Schale mit Glasboden mit den montierten Puppen in ein Weitfeldmikroskop, das mit einem abstimmbaren Laserablationssystem ausgestattet ist.
   1. Verwenden Sie einen luftgekühlten, stickstoffgepumpten Ablationslaser mit gepulstem UV-Widerstand, der auf 435 nm abgestimmt ist – siehe Materialtabelle für Details; die genaue Wellenlänge des für die Beleuchtung verwendeten Lichts wird vom Benutzer über eine geeignete Farbstoffzelle ausgewählt.
2. Stellen Sie mit Hilfe der Hellfeldoptik die Regler des Mikroskoptisches so ein, dass der Puppenflügel der ersten Puppe, die verwundet wird, lokalisiert wird (Abbildung 1F).
3. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie ein 40X- oder 63X-Ölimmersionsobjektiv sowohl für die Bildgebung als auch für die Laserablation. Stellen Sie sicher, dass die verwendete Immersionsflüssigkeit (Öl oder Glycerin) zwischen Ablations- und Bildgebungssystemen konsistent ist. Stellen Sie das Mikroskop mit dem Feinfokus-Drehknopf so ein, dass es auf die Ebene des Puppenflügelepithels fokussiert, die dem Glasdeckglas am nächsten liegt (d. h. fokussieren Sie auf den Bereich des Epithels, der verletzt werden soll).
4. Positionieren Sie den Puppenflügel mit Hilfe der Tischeinstellungen des Mikroskops so, dass der zu verwundende Bereich direkt mit dem bekannten Zielbereich des Ablationslasers ausgerichtet ist.
5. Verwenden Sie einen am Mikroskop angebrachten Objektträger mit Energiedichtedämpfung, um die Leistung des Ablationslichts manuell einzustellen.
   Anmerkung: Der Schieberegler für den Abschwächer verfügt über Klickstopps und -regeln, um den relativen Dämpfungsgrad zu ermitteln und die Verwendung reproduzierbarer Einstellungen zu ermöglichen.
6. Aktivieren Sie mit einer externen manuellen Auslösesteuerung den Ablationslaser mit einem einzigen kurzen Klick auf den Auslöser, um eine Wunde zu erzeugen. Prüfen Sie, ob die vorübergehende Luftblase an der Ablationsstelle auftritt, da sie normalerweise von einer Verwundung begleitet wird. Prüfen Sie, ob die laserinduzierte Verwundung erfolgreich war, indem Sie die entsprechenden Fluoreszenzfilter verwenden, um das Puppenepithel sichtbar zu machen.
   Anmerkung: Achten Sie darauf, dass Sie den Laserstrahlen nicht versehentlich ausgesetzt werden, da die Strahlreflexionen schwere Augen- oder Hautschäden verursachen können.
7. Wenn die Verwundung nicht erfolgreich ist, variieren Sie die Brennebene (bewegen Sie den Mikroskopfokus leicht über oder unter die aktuelle Brennebene) und wiederholen Sie den einfachen Klick des Ablationsauslösers. Alternativ können Sie die Laserleistung mit dem Abschwächerschieber schrittweise erhöhen, bis die gewünschte Wundgröße erreicht ist.
8. Um die Wiederholrate des Ablationslaserpulses zu variieren, verwenden Sie den Regler für die Wiederholrate auf der Rückseite (wodurch die Rate von weniger als 1 Impuls/s auf 60 Hz geändert wird). Für eine optimale Wicklung stellen Sie die Impulswiederholrate auf 40 Hz ein.
9. Um unterschiedlich große Wunden zu erzeugen, verwenden Sie den Schieber des Energiedichtedämpfungsglieds, um die Leistung des Ablationslichts manuell einzustellen.
10. Vermeiden Sie es, alle berittenen Puppen zu verwunden, und verwenden Sie diese nicht abgetragenen Puppen als unverwundete Kontrollen.
11. Um konsistente Ergebnisse zu erzielen, richten Sie das Ablationssystem regelmäßig neu aus (unter Verwendung der entsprechenden Bedienungsanleitung). Reinigen und befüllen Sie außerdem die Farbstoffresonatorzelle, die die Wellenlänge der Laserausgabe steuert.

>4. Konfokale In-vivo-Zeitraffer-Bildgebung

1. Übertragen Sie die Schale mit Glasboden schnell in ein geeignetes Mikroskop für Zeitrafferaufnahmen.
   Anmerkung: Für optimale Ergebnisse verwenden Sie ein hochspezifiziertes Konfokal- oder Spinning-Disc-Mikroskop, das mit empfindlichen Detektoren ausgestattet ist, die sowohl grün fluoreszierendes Protein (GFP) als auch mCherry-Fluorophore nachweisen können.
2. Um den gesamten Puppenflügel abzubilden, verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Vergrößerung (z. B. 20-fach) (Abbildung 2A). Um die Wundheilung und die damit einhergehende Entzündungsreaktion mit hoher räumlicher Auflösung darzustellen, verwenden Sie die Ölimmersionsobjektive 40X (NA 1,3) oder 63X (NA 1,4) (siehe repräsentative Bilder in Abbildung 2B-D).
3. Öffnen Sie die entsprechende Bildaufnahmesoftware, die mit dem Mikroskop verknüpft ist.
4. Schalten Sie mit der Bilderfassungssoftware die entsprechenden Laser ein, z. B. die 488-nm- und 561-nm-Laser, um GFP- bzw. mCherry-Fluorophore zu visualisieren (indem Sie in die entsprechenden Felder klicken) und passen Sie die Laserleistung und die Verstärkungs-/Offset-Einstellungen an, um ein ausreichendes Fluoreszenzsignal zu liefern und gleichzeitig eine Pixelsättigung zu vermeiden. Verwenden Sie die geringstmögliche Laserleistung (im Bereich von 5 - 20 %), um Photobleiche und Phototoxizität zu minimieren.
5. Um sowohl das reparierende Epithel als auch die Rekrutierung von Entzündungszellen zu erfassen, stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es mit den Feinfokus-Einstellknöpfen auf dem Bedienfeld einen Z-Stapel aufzeichnet. Für optimale Ergebnisse stellen Sie die Software (mit manuellen Tastenklicks) so ein, dass Z-Schichten durch den Puppenflügel (mindestens alle 3 mm) aufgezeichnet werden, von der Oberseite des verwundeten Epithels bis zum extrazellulären Raum darunter (mit wandernden Hämozyten), um einen großen Z-Stapel (im Bereich von 50 - 100) zu erreichen mm).
6. Für Zeitrafferaufnahmen zeichnen Sie Z-Stacks in regelmäßigen Zeitabständen (mindestens alle 30 s) für mindestens 1 Stunde nach der Verwundung auf.
   Anmerkung: Das genaue Zeitintervall zwischen den gewählten Z-Stacks stellt einen Kompromiss zwischen der Erfassung der sich schnell ändernden Zelldynamik und der Vermeidung von Photobleichen der Proben dar.
7. Um mehrere Puppen gleichzeitig abzubilden (einschließlich nicht abgetragener, nicht verwundeter Kontrollen), verwenden Sie einen motorisierten Tisch (am Mikroskop befestigt) und die in der Bildgebungssoftware verfügbare Multipositionserfassungsfunktion. Stellen Sie die Position jeder Puppe manuell in der Software mit den Reglern für die Tischposition ein und stellen Sie dann manuell die entsprechenden Z-Stack-Grenzwerte (oben und unten) für jede Puppe ein.
8. Visualisieren Sie die Zeitrafferbilder entweder während der Bildaufnahme oder später mit einer speziellen Bildanalysesoftware (z. B. ImageJ) unter Verwendung von Z-Stack-Projektionen oder 3D-Rendering. Um beispielsweise die Bewegungen einzelner Hämozyten zu verfolgen (wie in Abbildung 2C' und D'), verfolgen Sie Hämozytenkerne mit den frei zugänglichen ImageJ-Plug-Ins "TrackMate" oder "Manual Tracking" (Methoden, die in veröffentlicht wurden).
9. Verwenden Sie photokonvertierbare Sonden (z. B. Kaede), um eine Untergruppe von Epithel- oder Immunzellen während der Bildgebung selektiv photoumzuwandeln und zu markieren.
   1. Öffnen Sie die entsprechenden Module in der Bildgebungssoftware, um die Photokonvertierung durchzuführen (z. B. das Modul Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleaching (FRAP) und die Fluoreszenzwiederherstellung nach dem Photobleichen) und aktivieren Sie den 405-nm-Laser (indem Sie in das entsprechende Softwarefeld klicken).
   2. Wählen Sie Zellen aus, die in der FRAP-Software mit dem quadratischen, kreisförmigen oder Freihand-Auswahlwerkzeug fotokonvertiert werden sollen. Stellen Sie in der FRAP-Software den Zeitverlauf für die Photokonversion (Bleaching) auf eine einzelne Iteration/Frame ein und stellen Sie den 405-nm-Laser auf 20 % Laserleistung ein. Klicken Sie manuell auf Experiment starten, um die Fotokonvertierung durchzuführen.
   3. Beenden Sie das FRAP-Modul (klicken Sie auf Schließen) und kehren Sie zum ursprünglichen Bildgebungsbildschirm in der Software zurück. Verwenden Sie die 488-nm- und 561-nm-Laser, um das Verhalten von fotokonvertierten und nicht fotokonvertierten Zellen abzubilden, indem Sie einen Z-Stack und eine Zeitrafferaufnahme wie oben einrichten.
      Anmerkung: Photokonvertierte Sonden bleiben nach der ersten Photokonversion viele Stunden lang stabil, so dass das Verhalten der photokonvertierten Zellen über einen längeren Zeitraum (mindestens 5 Stunden) verfolgt werden kann. Zum Beispiel können Entzündungszellen in der Wunde selektiv photokonvertiert werden (Abbildung 2F) und ihr Verhalten verfolgt werden, während sie sich von der Verletzungsstelle lösen (Abbildung 2G und H).

Results

Abbildung 1: Vorbereitung der Drosophila-Puppe für die Verwundung und Live-Bildgebung. (A) Drosophila weiße Vorpuppen, die bei 0 h APF gesammelt wurden, wobei das vordere Ende durch umgestülpte Atemanhänge (Spiracles) angedeutet ist. (B) Nach 18 h weißer 0h APF-Prepupae bei 25 °C erscheint das Puparium braun. Die Dissektion der Puppenhülle sollte...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila-Aktien
Allgegenwärtiges GFP-markiertes E-Cadherin; Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)	Kyoto Stock Center, DGRC	#109007	Ubi-p63E-Promotorsequenzen steuern die Expression von Drosophila E-Cadherin (Shotgun), das am C-terminalen Ende mit GFP markiert ist.
Allgegenwärtiges GFP-markiertes E-Cadherin; Ubi-p63E-shg.GFP (III)	Bloomington Drosophila Stock Centre (Universität von Indiana)	#58742	Ubi-p63E-Promotorsequenzen steuern die Expression von Drosophila E-Cadherin (Shotgun), das am C-terminalen Ende mit GFP markiert ist.
Ubiquitäres GFP-getaggtes Moesin P{sGMCA}3.1	Bloomington Drosophila Stock Centre (Universität von Indiana)	#59023	Der ubiquitär exprimierte sqh-Promotor/Enhancer steuert die Expression eines Fragments von Moesin (das die Aktin-Bindungssequenzen enthält), das mit GFPS65T markiert ist.
Hämozytenspezifischer Schlangen-Gal4-Treiber ; srp-Gal4;	Generiert von Katja Bruckner	Generiert von Katja Bruckner	Die Expression von Scer\GAL4, das mit einem polyA-Schwanz fusioniert ist, wird durch 2 genomische Sequenzen aus dem Oberstrom der Drosophila-Schlange kontrolliert. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. Der PDGF/VEGF-Rezeptor steuert das Überleben der Blutzellen in Drosophila. Dev-Zelle. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nuklearRFP w1118;; P{UAS-RedStinger}6	Bloomington Drosophila Stock Centre (Universität von Indiana)	#8545 oder #8547	UAS-regulatorische Sequenzen steuern die Expression der DsRed.T4-Form von RFP, die am C-terminalen Ende mit einem nuklearen Lokalisierungssignal markiert ist
UAS-zytoplasmatischGFP ;; P{UAS-GFP. S65T}	Bloomington Drosophila Stock Centre (Universität von Indiana)	Mehrere Lagerbestände verfügbar (z.B. #1522)	Expression der S65T-Version von GFP durch UAS-regulatorische Sequenzen; die S65T-Variante weist eine erhöhte Helligkeit auf.
UAS-FotokonverteidigKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3	Bloomington Drosophila Stock Centre (Universität von Indiana)	#26161	Das Kaede-Protein emittiert nach der Synthese eine hellgrüne Fluoreszenz, wandelt sich aber bei Bestrahlung mit UV effizient in eine helle, stabile rote Fluoreszenz um.
Spaghettikürbis mit GFP-Tag w1118;; P{sqh-GFP.RLC}	Bloomington Drosophila Stock Centre (Universität von Indiana)	#57145	Die sqh-kodierende Region, die am C-terminalen Ende mit einem T:Avic\GFPS65T-Tag markiert ist, wird unter der Kontrolle des natürlichen sqh-Promotors exprimiert.
Zutaten für Fliegenfuttermedien			Fliegenfuttermedien werden nach Standardverfahren hergestellt (vgl. Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: Die Theorie und Praxis der Drosophila-Genetik. Cold Spring Harbor Press. 1-191 Seiten)
Mais	Wild Oats, Bristol, UK (oder gleichwertiger Lieferant)	Kontaktieren Sie den Lieferanten direkt	organisch
Sojamehl	Wild Oats, Bristol, UK (oder gleichwertiger Lieferant)	Kontaktieren Sie den Lieferanten direkt	organisch
Malz-Extrakt	Wild Oats, Bristol, UK (oder gleichwertiger Lieferant)	Kontaktieren Sie den Lieferanten direkt	organisch
Melasse	Wild Oats, Bristol, UK (oder gleichwertiger Lieferant)	Kontaktieren Sie den Lieferanten direkt	organisch
Difco-Agar	BD Biosciences, Fisher Scientific	DF0142-15-2	Für die Zubereitung von Fliegenfutter
Propionsäure	Sigma	402907	Für die Zubereitung von Fliegenfutter
Nipagen	Sigma	Artikel-Nr.: 79721	Für die Zubereitung von Fliegenfutter
Getrocknete Backhefe	Redstar, Dutscher Scientific, Großbritannien Ltd	Redstar, Dutscher Scientific, Großbritannien Ltd	Für die Zubereitung von Fliegenfutter
Probenvorbereitung und -einbettung
Parafilm	Sigma	Nr. P7793-1EA	Zur Herstellung von Heptankleber
Feiner Zobelpinsel	Daler-Rowney (oder gleichwertig)	#0 oder 1
Zange	Fisher Scientific (oder Fine Science Tools)	NC9404145	Dumont #5
Schalen mit Glasboden für die Bildgebung	MatTek	P35G-0-10-C	Wir empfehlen die Verwendung von 35-mm-Petrischalen mit mindestens einem 10-mm-Mikrowell-Deckglas von 0,085-0,13 mm, unbeschichtet. Schalen mit größeren Mikrovertiefungen werden es ermöglichen, eine größere Anzahl von Puppen in einem einzigen Experiment zu montieren und abzubilden.
Heptan	Sigma	Artikel-Nr.: 51730-5ML	Zur Herstellung von Heptankleber
Doppelseitiges Klebeband (z.B. Scotch)	Agar Wissenschaftlich	Nr. AGG263	Zur Herstellung von Heptankleber
50ml Tube (für Heptankleber)	Falcon-Röhren von Fisher Scientific	Tel.: 14-432-22	Zur Herstellung von Heptankleber
Objektträger aus Glas	Agar Wissenschaftlich	AGL4244	Zum Sezieren von Drosophila-Puppen
Präparierendes Stereomikroskop mit Hellfeld	Leica (oder gleichwertig)	M50	Zum Sezieren von Drosophila-Puppen
Mikroschere	John Weiss International	103123	Miniatur-Forschungsschere (gerade)
Laserablation und Bildgebung
Nitogen Ablationslaser	Spectra-Physics (oder Andor Äquivalent)	Modell VSL-337ND-S	Für die Verwundung sollte dieses an ein Weitfeld-Bildgebungssystem angeschlossen werden
Konfokales Multilaser-Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM)	Leica (oder gleichwertig)	TCS AOBS SP8 oder SP5-II an einem inversen Epifluoreszenzmikroskop Leica DMi8 (oder gleichwertig)	Idealerweise mit einem motorisierten Tisch für Multi-Site- und "Mosaik"-Scans sowie "Hybrid"-GaAsP-Detektoren (die eine viel höhere Empfindlichkeit und Verstärkung bei niedrigen Signalen bieten)
Klimakammer	Life Imaging Services (oder gleichwertig)	"Mikroskop-Temperiersystem"	Befestigung am Konfokalmikroskop zur Temperaturkontrolle während der Bildgebung
Bildanalyse-Software
FRAP-Software-Modul	Leica (oder gleichwertig)	CLSM FRAP Software-Modul	Zur Photokonversion von photokonvertierbaren Fluorophoren wie z.B. Kaede
ImageJ (Bildanalyse-Software)	Nationale Institute für Gesundheit (NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/	Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 Jahre Bildanalyse". Naturmethoden 9, 671-675, 2012.
ImageJ Plugin "Manuelles Tracking"	Nationale Institute für Gesundheit (NIH)	https://imagej.net/Manual_Tracking
ImageJ Plugin "TrackMate"	BildJ, NIH	https://imagej.net/TrackMate	Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: Eine offene und erweiterbare Plattform für die Einzelteilchenverfolgung.", Methoden 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (Hochleistungs-3D-Bildgebungssoftware)	Perkin Elmer	Volocity 6.3	Für die Bildanalyse
IMARIS (Bildanalyse-Software)	Bitplane	IMARIS für Zellbiologen	Für die Bildanalyse