Ein Opsono-Adhärenz-Assay zur Beurteilung der Opsonisierung von verkapselten Bakterien durch Anti-Kapsel-Antikörper

Zusammenfassung

Quelle: Chua, J., et al. Opsono-Adhärenz-Assay zur Bewertung funktioneller Antikörper in der Impfstoffentwicklung gegen Bacillus anthracis und andere verkapselte Krankheitserreger. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt einen Opsono-Adhärenz-Assay zur Untersuchung der Interaktion zwischen opsonisierten Bakterien und Immunzellen. Fluoreszenzmarkierte Bakterien, die mit Testserum behandelt werden, das Anti-Kapsel-Antikörper enthält, werden mit Makrophagen inkubiert. Nach der Färbung der Makrophagen mit Fluoreszenz werden die auf der Makrophagenoberfläche anhaftenden Bakterien zur Visualisierung unter einem Mikroskop betrachtet.

Protokoll

1. Bakterienkulturen und -zubereitungen

HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendete Bakterienart ist ein verkapselter virulenter Stamm, B. anthracis Ames. Alle Manipulationen mit dieser Tierart erfordern entsprechende Biosicherheits- und Sicherheitsfreigaben und müssen in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II oder III durchgeführt werden, die sich in einem BSL-3-Labor befindet. Befolgen Sie die institutionellen Betriebsanweisungen für BSL-3-Arbeiten und für die Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung beim Umgang mit Bakterien.

1. Bereiten Sie die Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Brühe zu, indem Sie 37 g BHI-Pulver in 1 L Wasser auflösen und 15 Minuten lang bei 121 °C autoklavieren. Brühe bei Raumtemperatur lagern.
2. 8%ige Natriumbicarbonatlösung in Wasser zubereiten und mit einer 0,20 μm Filterspritze sterilisieren. Lösung bei 4 °C lagern und innerhalb von 1 Tag verbrauchen.
3. Mischen Sie 8 g Nährbrühe, 3 g Hefeextrakt und 15 g Agar in 1 L Wasser, um NBY-Agarplatten zuzubereiten. Autoklav bei 121 °C für 15 min. In Petrischalen füllen und fest werden lassen. Teller bei 4 °C lagern.
   HINWEIS: NBY-Agarplatten können mit oder ohne Natriumbicarbonat hergestellt werden. Die Zugabe von Natriumbicarbonat zu Brühe und Agarplatten induziert das Wachstum von Schleimhautkolonien, die aus verkapselten Bazillen bestehen. Die Endkonzentration von Natriumbicarbonat sowohl in flüssigen als auch in festen Medien beträgt 0,8 %.
4. Bereiten Sie Kulturbrühe für B. anthracis vor, indem Sie 50 % autoklavierte BHI-Brühe, 40 % FBS und 10 % Natriumbicarbonatlösung (v/v) mischen.
   HINWEIS: Diese Brühe ist so formuliert, dass sie kurze Ketten von verkapselten Bazillen produziert.
5. Bereiten Sie eine Masterplatte von B. anthracis vor, indem Sie sie einen Tag vor der Kultivierung in Brühe auf einer NBY-Agarplatte aus einem Sporenvorrat isolieren. Inkubieren bei 37 °C.
6. 30 ml Kulturbrühe werden in einem belüfteten 250-ml-Kolben mit mehreren Kolonien von B. anthracis beimpft.
   HINWEIS: Ein spezifisches Volumen-zu-Oberflächen-Verhältnis der Brühe, wie hier angegeben, ist erforderlich, um maximal verkapselte Bazillen zu erzeugen.
7. Die Brühekultur bei 125 U/min, 37 °C mit 20 % CO₂ und Feuchtigkeit 18–24 h schütteln.
   HINWEIS: Der Anbau von B. anthracis bei Temperaturen über 37 °C kann die Kapselproduktion hemmen.
8. Verwenden Sie eine Negativfärbung mit Tusche, um eine ausreichende Verkapselung zu gewährleisten und sicherzustellen, dass die Bazillen vor der Fixierung in kurzen Ketten (1–5 Bazillen/Kette) liegen (siehe Abschnitt 2).
9. Zur Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (KBE) werden 100 μl der Kultur seriell 1:10 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und die Plattenkulturverdünnungen auf Schafblutagarplatten aufgetragen. 12–18 h bei 37 °C inkubieren. Zählen Sie die KBE und bestimmen Sie die Anzahl der Bakterien pro ml Kultur.
   HINWEIS: Die Zählung kann auch mit einem Hämozytometer unter dem Mikroskop durchgeführt werden, sobald die Bakterien fixiert wurden. Dies ist jedoch nicht zu empfehlen, da die Bazillen bei geringer Vergrößerung schwer zu erkennen sind.
10. Fügen Sie dem gesamten Volumen der Bakterienkultur 16 % Paraformaldehyd (PF) in einer Endkonzentration von 4 % PF hinzu, um die Bazillen zu fixieren. Auf einem Shaker bei Raumtemperatur 7 Tage lang langsam rühren.
    HINWEIS: Sieben Tage Inkubation in 4% PF basieren auf der institutionellen Standardarbeitsanweisung des United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) zur Fixierung vegetativer Bazillen.
11. Um das Fixiermittel zu entfernen und auf Sterilität zu testen, waschen Sie dreimal 4 ml (10 % Volumen) fixierte Bakteriensuspension in einem konischen 50-ml-Röhrchen durch Zentrifugation bei ≥3000 x g für 45 Minuten und unter Verwendung einer 30 ml/Waschgang mit PBS. Die verbleibende Probe wird in 4 % PF bei 4 °C gelagert.
    HINWEIS: Nach dem Pelletieren ist das Bakterienpellet aufgrund des Vorhandenseins einer Kapsel flauschig. Achten Sie darauf, das Pellet während des Waschens nicht zu stören. Es ist notwendig, alle Fixiermittel zu entfernen, damit sie die Lebensfähigkeitsprüfung nicht beeinträchtigen. Erhöhen Sie bei Bedarf die Anzahl der Wäschen.
12. Für die Viabilitätsprüfung werden 40 ml eines bakteriellen Wachstumsmediums (z. B. BHI-Brühe) mit 4 ml gewaschener Suspension (≤ 10 % des Brühevolumens) inokuliert und 7 Tage lang bei 37 °C inkubiert. Überprüfen Sie die optische Dichte bei 600 nm vor und nach 7 Tagen, um die Trübung zu messen.
13. Nach 7 Tagen Inkubation in Bouillonkultur ≥100 μl Brühe auf eine Agarplatte geben und weitere 7 Tage inkubieren. Wenn keine Zunahme der Trübung und kein Wachstum auf den Platten zu beobachten sind, gilt die ursprüngliche Kultur als steril und kann in ein BSL-2-Labor überführt werden.
    HINWEIS: Das Federal Select Agent Program schreibt vor, dass inaktivierte B. anthracis nur dann aus BSL-3-Laboratorien übertragen werden dürfen, wenn die Sterilität der Probe vollständig nachgewiesen wurde. Die Viabilitätsprüfung auf inaktivierte B. anthracis besteht aus der Kultivierung von 10 % der Probe in Brühe für 7 Tage und der anschließenden Kultivierung auf einem festen Untergrund für weitere 7 Tage. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien, um die Verlegungsgenehmigung zu erhalten, sobald die Sterilität festgestellt ist.

2. Negativfärbung und Lichtmikroskopie zur Beobachtung der Verkapselung und der Bazillenketten

1. Mischen Sie 5 μl Bakteriensuspension mit 2 μl Tusche auf einem Objektträger. Platzieren Sie ein 1 oder 1,5 μm dickes Deckglas auf der Suspension, ohne Blasen zu bilden.
   HINWEIS: Nagellack kann verwendet werden, um das Deckglas auf dem Objektträger zu versiegeln.
2. Beobachten Sie die Bakteriensuspension mit einer 40- bis 100-fachen Ölobjektive an einem Lichtmikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Bazillen eingekapselt sind, indem Sie eine Abstandszone (Kapsel ohne Tusche) beobachten, die jedes Bakterium umgibt, und dass die Bazillenketten kurz sind.

3. FITC-Markierung von Bakterien

1. Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 2 mg/ml lösen.
2. Messen Sie das Volumen des inaktivierten Bakterienbestands.
3. Waschen Sie die Brühe 3x in PBS, um das Fixiermittel zu entfernen.
4. FITC-Lösung in einer Endkonzentration von 75 μg/ml zugeben. Die Mischung 18–24 h bei 4 °C langsam rühren.
5. Waschen Sie die Bakterien dreimal, indem Sie sie bei ≥3000 x g, 45 Minuten pelletieren und 30 mL PBS/Wäsche verwenden, um überschüssiges FITC zu entfernen. Achten Sie darauf, dass das flauschige Pellet beim Waschen nicht gestört wird. Resuspendieren Sie die Bazillen in PBS bei gleicher Startlautstärke.
6. Aliquotieren Sie die Bazillen und lagern Sie sie bis zur Verwendung in Mikroröhrchen bei -20 °C. Frieren/tauen Sie die Bazillen nicht mehrmals ein, da die Bazillen ihre Kapsel verlieren können.

4. Bakterielle Opsonisation

1. Ein kleines Volumen der Testseren (von nichtmenschlichen Primaten, NHPs) wird 30 min lang in einem Wärmeblock bei 56 °C hitzeinaktiviert.
2. FITC-markierte Bakterien mit PBS 2x auftauen und waschen, indem sie 3–5 Minuten lang bei 15000 x g pelletieren. Resuspend in PBS bei gleicher Startlautstärke.
3. In einer runden 96-Well-Bodenplatte (Platte #2) werden die Testseren seriell in Zellmedium verdünnt. Geben Sie in eine weitere runde 96-Well-Bodenplatte (Platte #3) 10 μl verdünnte Testseren in jede Vertiefung.
   HINWEIS: In jeder Platte wurden PBS und normale Affenseren anstelle von verdünnten Testseren als Negativkontrollen eingeschlossen. Wir wählten auch ein Testserum als Positivkontrolle, um eine Standardkurve zu erstellen, die alle an verschiedenen Tagen durchgeführten Assays normalisiert. Das Positiv-Kontroll-Testserum wurde willkürlich gewählt, weil es reichlich vorhanden war.
4. Zu Platte #3 10 μl frisch rekonstituiertes Kaninchen-Komplement hinzufügen.
   HINWEIS: Sobald es wieder hergestellt ist, entsorgen Sie das restliche Kaninchenbaby-Ergänzungsfutter; Nicht wieder einfrieren und auftauen.
5. Fügen Sie zu Platte #3 das entsprechende Volumen an FITC-markierten Bazillen hinzu, um eine Infektionsvielfalt von 1:20 zu erreichen. Fügen Sie z. B. das Volumen hinzu, das 5 x 10⁴ x 20 Bazillen für 5 x 10⁴ Zellen enthält. Füllen Sie jede Vertiefung in Platte #3 mit dem entsprechenden Volumen des Zellmediums auf insgesamt 105 μl auf.
   HINWEIS: Platte #1, die Zellen enthält, erhält 100 μl opsonisierte Bakterien mit den restlichen 5 μl als Hohlraumvolumen. Wir haben jede Verdünnung der Testseren in zweifacher Ausführung getestet.
6. Platte #3 bei 37 °C für 30 min in Gegenwart von 5 % CO₂ mit Feuchtigkeit inkubieren, um die Bazillen zu opsonisieren.

5.Adhärenzassay und Fluoreszenzmarkierung von Säugetierzellen

1. Halten Sie alle Reagenzien vor der Verwendung bei 37 °C.
2. Legen Sie die Platte #1, die anhaftende Zellen enthält, auf einen 37 °C heißen Heizblock.
3. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen zu entfernen und es schnell durch 100 μl opsonisierte Bakterien aus Platte #3 zu ersetzen. Stellen Sie sicher, dass während des Pipettiervorgangs keine Blasen in den Vertiefungen gebildet wurden. Inkubieren Sie die Platte #1 bei 37 °C mit 5% CO₂ und Feuchtigkeit für 30 min für die Adhärenz.
4. Waschen Sie jede Vertiefung 5x mit 150 μl PBS auf einem 37 °C heißen Block, um nicht anhaftende Bazillen zu entfernen.
   HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass die Zellen beim Waschen nicht versehentlich dispergiert werden.
5. Verdünnen Sie 16 % PF mit PBS 1:4, um 4 % PF zu erhalten. Fixieren Sie die Zellen mit 4 % PF für 1 h, indem Sie 150 μl in jede Vertiefung geben. Waschen Sie die Zellen 2x mit PBS.
6. Mischen Sie 2 μl HCS (High-Content Screening) Orange Cell Stain in 10 mL PBS. 150 μl dieser Färbelösung werden in fixierte Zellen gegeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
7. Waschen Sie die Vertiefungen 2x mit PBS.
8. Bis zur Mikroskopie bei 4 °C lagern.

6. Mikroskopie

HINWEIS: Im Allgemeinen erleichtert ein automatisiertes Fluoreszenzmikroskop mit hohem Durchsatz die Bildgebung für das OAA. Wenn ein automatisiertes System nicht verfügbar ist, können Fluoreszenzbilder von anhaftenden Bazillen manuell aufgenommen werden. In dieser Studie wurden adhärente Bazillen und Zellmonoschichten mit dem Zeiss 700 Laser-Scanning-Mikroskopiesystem mit speziellen Geräten abgebildet; Unser System bestand aus dem inversen Mikroskop Zeiss Axio Observer Z1, das mit einem automatisierten Tisch ausgestattet ist, dem Definite Focus-Modul, dem 40 x NA 0,6-Objektiv, der Axio Cam HRc-Kamera und der Software Zen 2012 (Blue Edition). Bei den aufgenommenen Bildern handelt es sich um Weitfeldbilder, nicht um konfokale Bilder. Das folgende Protokoll ist als grundlegender Mikroskopaufbau gedacht, der auf eine Vielzahl von automatisierten Mikroskopiesystemen anwendbar ist.

1. Inkubieren Sie die Platte #1 bei Raumtemperatur für 30 min. Schalten Sie das Mikroskop und die zugehörige Ausrüstung ein.
   HINWEIS: Die Akklimatisierung bei Umgebungstemperatur verhindert, dass sich während der Bildgebung Kondenswasser auf der Glasplatte bildet. Darüber hinaus verhindert es eine Defokussierung aufgrund von Temperaturverschiebungen.
2. Stellen Sie die Platte auf den Tisch und fokussieren Sie sich mit einem Hellfeld- oder Phasenkontrast auf die Zellen.
3. Wählen Sie als Platteneinstellung 96-Well-Format aus. Wählen Sie die Kanaleinstellungen aus.
   HINWEIS: Die Spitzenanregungs- und Emissionswellenlänge von FITC beträgt 495/519 nm; die HCS-Orangezellfärbungen sind 556 und 572 nm. Abhängig von den am Mikroskop verfügbaren Filtern können auch andere Fluorophore verwendet werden.
4. Wählen Sie die Einstellung auf Kachelmodus aus. Geben Sie die Anzahl der Bilder an, die erfasst werden sollen.
   HINWEIS: Die Kachelfunktion ermöglicht die Erfassung mehrerer Positionen in einer Probenvertiefung und kann so eingestellt werden, dass ein Bild in einem Kachel- oder einem zufälligen Format aufgenommen wird. Wir haben 10 zufällige Bereiche pro Vertiefung abgebildet.
5. Ändern Sie den Aufnahmemodus auf "Schwarzweiß" oder "Monochrom" und Binning ≥ 2x2.
   HINWEIS: Das Festlegen des Binnings von 1x1 auf 2x2 oder 4x4 würde die Mikroskopiegeschwindigkeit erhöhen, aber auch zu einer geringeren Auflösung des Bildes führen. Für OAA ist es ausreichend, diese Einstellungen zu verwenden, da der Assay sowohl die Makrophagen als auch die adhärenten Bakterien aufzählt.
6. Schalten Sie das Autofokus- oder Fokussiermodul ein. Geben Sie an, wie oft die Autofokusfunktion ausgeführt werden soll. Aktivieren Sie die Z-Stapel-Funktion, falls verfügbar. Geben Sie die Anzahl der Z-Stapel an, die die Dicke der Zellmonoschicht und der anhaftenden Bazillen erfassen.
   HINWEIS: Die Anzahl der gewählten Z-Stapel erhöht die Mikroskopiezeit, stellt aber sicher, dass an jedem Z-Stapel ein Bild mit dem richtigen Fokus aufgenommen wird.
7. Legen Sie einen Dateiordner fest, in dem Bilder gespeichert werden sollen. Führen Sie das automatisierte Imaging-Programm aus.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,20 μm Spritzenvorsatzfilter (25 mm, regenerierte Zellulose)	Corning, Corning, Vereinigte Staaten von Amerika	431222
10 ml Spritze (Luer-Lock-Spitze)	BD, Franklin Seen, NJ	302995
15μ 96 Well schwarze Platten (Platte #1 für die Bildgebung)	In Vitro Scientific, Sunnyvale, Kalifornien	P96-1-N
16 % Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie, Hatfield, PA	15710
75 cm großer Kolben mit Gewebekultur	Corning, Corning, Vereinigte Staaten von Amerika	430641
Agar (Pulver)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Nr. A1296
Baby Rabbit Ergänzung	Cedarlane Labs, Burlington, NC	CL3441
Bacto-Hefe-Extrakt	BD, Funken, MD	288620
BBL Hirn-Herz-Infusion (BHI)	BD, Funken, MD	211059
Blut-Agar-Platten (TSA mit Schafsblut)	Remel, Lenexa, KS	R01198
Zellschaber	Sarstedt, Newton, NC	83.183
Costar 96-Well-Zellkulturplatten (Platten #2 und 3 für Verdünnungen)	Corning, Corning, Vereinigte Staaten von Amerika	3596
Deckglas	Elektronenmikroskopie, Hatfield, PA	72200-10
Difco Nährstoffbrühe	BD, Funken, MD	234000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	11965-092	Enthält 4500 mg/L Glukose, 4 mM L-Glutamin, Phenolrot
EVOS FL Auto Cell Imaging System (Fluoreszenzmikroskop)	Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	AMAFD1000
Fötales Rinderserum	Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT	SH30071.03	Nicht gammabestrahlt, nicht wärmeinaktiviert
Fluorescein-Isothiocyanat	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	F143
HCS Zellmaske Orange Zellfleck	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	H32713
Hämozytometer (verbesserter Neubauer)	Hausser Scientific, Horsham, PA	3900
Tusche-Lösung	BD, Funken, MD	261194
L-Glutamin (200 mM)	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA	25030081	Supplement Medium mit zusätzlichen 2mM L-Glutamin
Nikon Eclipse TE2000-U (inverses Durchlichtmikroskop)	Nikon Instruments, Melville, NY	TE2000
PBS ohne Calcium oder Magnesium	Lonza, Walkersville, MD	17-516F
Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100x	Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT	SV30010
Petrischalen (100 x 15 mm)	Falke, Corning, Durham, NC	351029	Für Agarplatten
RAW 264.7 Makrophagen-Zelllinie (Tib47)	ATCC, Manassas, VA	ATCC TIB-71
Folien	VWR, Radnor, PA	16004-422
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Nr. S5761
Trypanblau-Lösung (0,4%)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8154
Zeiss 700 Laser-Scanning-Mikroskopie (Konfokalmikroskop)	Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY	4.109E+15