Evaluierung der kontrollierten T-Zell-Aktivierung mit einem photoaktivierbaren Peptid MHC

Zusammenfassung

Quelle: Sanchez, E., et al. Räumliche und zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung mit einem photoaktivierbaren Agonisten. J. Vis. Exp. (134), (2018)

Dieses Video zeigt eine Methode zum Entkoffeinieren eines photoaktivierbaren Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplexes mittels UV-Bestrahlung. Durch den Deaktivierungsprozess wird die native Peptidsequenz freigelegt, was eine präzise Aktivierung der T-Zellen ermöglicht.

Protokoll

>1. Vorbereitung von stimulierenden Glasoberflächen

1. Deckglas mit acht Well-Kammern mit biotinyliertem Poly-L-Lysin (Bio-PLL) beschichten, das 1:500 in destilliertem, entionisiertem Wasser (ddH₂O) verdünnt wurde. 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
2. Mit H₂O waschen.
3. 2 h bei RT trocknen.
4. Blockieren Sie Bio-PLL-beschichtete Oberflächen mit Blockierungspuffer (HEPES-gepufferte Kochsalzlösung [10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl], mit 2% BSA) für 30 min bei RT.
   1. 5 mg Poly-L-Lysinhydrobromid in 1 mL 10 mM NaPO4, pH 8,5, lösen.
   2. Fügen Sie 125 μmol (0,55 mg) NHS-Biotin (aus einem Stamm von 100 mg/ml in DMSO) hinzu und überprüfen Sie den pH-Wert der Reaktion. Wenn der pH-Wert unter 8,5 liegt, fügen Sie 2 μl 4 N NaOH hinzu, um ihn auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9,5 zu erhöhen.
   3. 30 Min. Vortexen.
   4. Quenden Sie die Reaktion mit 50 μl 100 mM Glycin, gelöst in 20 mM Tris pH 8,0.
   Bei
   5. voller Leistung 10 min drehen und den Überstand in eine neue Röhre umfüllen.
      HINWEIS: Die Qualität von Bio-PLL wird in der Regel mit früheren Präparaten verglichen, indem serielle zweifache Verdünnungen des Materials auf eine 96-Well-ELISA-Platte aufgetragen und der Biotingehalt nach der Inkubation mit alkalischem Phosphatase-gekoppeltem Streptavidin quantifiziert wird.
5. Entfernen Sie den Blockierungspuffer. Lassen Sie die Vertiefungen nicht trocknen. Fügen Sie Streptavidin (100 μg/ml in Blockierungspuffer) hinzu. 1 h bei 4 °C inkubieren.
6. In HBS waschen. Füllen und invertieren Sie die Kammerschieber 4 - 5 Mal, indem Sie HBS aus den Vertiefungen entfernen. Lassen Sie die Vertiefungen nicht trocknen.
7. Geben Sie die biotinylierten pMHC-Liganden und Adhäsionsmoleküle an die Oberfläche.
   Anmerkung: MCC und OVA können photokäfigiert werden, indem ortho-nitrobenzylbasierte Schutzgruppen (z. B. Nitrophenylethyl (NPE) oder Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) zur ε-Aminogruppe der Schlüssellysine (K12 in MCC, K7 in OVA)) hinzugefügt werden. Photokäfig-MCC und OVA können von kommerziellen Anbietern bezogen werden. Nach der Rekonstitution in wässrigem Puffer werden sie mit etablierten Ansätzen wieder in bakteriell exprimierte I-E k und H2-K^b gefaltet.
8. Validierung von photoaktivierbarem MCC- oder OVA-Peptid
   1. Dekogieren Sie NVOC-geschützte Peptide durch UV-Bestrahlung mit einer tragbaren UV-Lampe (siehe Materialtabelle) für 20 min bei RT.
   2. Pulsieren Sie 1,0 x 10⁵ APCs mit 1 μM nicht-stimulatorischem Peptid (Negativkontrolle, z. B. Hb), unbestrahltem photoaktivierbarem Peptid, bestrahltem photoaktivierbarem Peptid und Agonistenpeptid (Positivkontrolle, z. B. MCC) für 1 h bis über Nacht bei 37 °C.
   3. Zur Stimulierung von T-Zellen, die das 5C exprimieren. C7/2B4/UND TCR, verwenden Sie CH12- oder CH27-B-Zellen. Um OT1-T-Zellen zu stimulieren, verwenden Sie RMA-s- oder EL4-Thymomzellen.
   4. Mischen Sie die gepulsten APCs mit der gleichen Anzahl von T-Zellen in 96-Well-Platten mit rundem Boden bei einem Endvolumen von 200 μl. Inkubieren Sie bei 37 °C für 12 - 24 Stunden.
   5. Die Überstände aus jeder Vertiefung werden gewonnen und IL-2 mittels ELISA mit kolorimetrischem Nachweis der Streptavidin-Meerrettichperoxidase analysiert.
      HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, den Einkäfigstatus aller Peptide vor der Wiederfaltung in MHC-Komplexe durch Elektrospray-Massenspektrometrie zu bestätigen.
9. Führen Sie die Faltung und Reinigung von MHC durch, um die Lichteinwirkung zu minimieren. Wickeln Sie z.B. Faltreaktionen in Aluminiumfolie ein und führen Sie die Gelfiltrationschromatographie mit ausgeschalteter UV-Lampe durch.
   Anmerkung: Es wurde festgestellt, dass photoaktivierbare MCC-I-E^k und OVA-H2-K^b bei hoher Dichte eine UV-unabhängige T-Zellaktivierung induzieren, möglicherweise aufgrund einer unvollständigen funktionellen Käfighaltung. Daher wird das photoaktivierbare pMHC während des Immobilisierungsschritts zu einem 10- - 30-fachen Überschuss an nicht-stimulierendem pMHC (z.B. I-E^K, das das Hämoglobinpeptid (Hb) enthält) verdünnt. Dadurch wird das Signal-Rausch-Verhältnis des nachfolgenden bildgebenden Experiments verbessert.
10. Um CD4⁺ T-Zellen zu photoaktivieren, verwenden Sie gemeinsam eine Mischung aus biotinyliertem Hb-I-Ek (3 μg/ml), biotinyliertem photoaktivierbarem MCC-I-E^k (0,1 μg/ml) und biotinyliertem Antikörper gegen das Klasse I MHC H2-K^k (0,5 μg/ml). Der Anti-H2-K^{k-Antikörper} fördert 5C. C7/2B4/UND T-Zellen, die H2-K^k exprimieren, um sich ohne Aktivierung auf der Glasoberfläche auszubreiten.
11. Für CD8⁺ T-Zellen verwenden Sie eine Mischung aus biotinyliertem H2-Db mit dem Peptid KAVYDFATL (1 μg/ml), biotinyliertem photoaktivierbarem OVA-H2-Kb (0,1 μg/ml) und der extrazellulären Domäne des Adhäsionsmoleküls ICAM-1 (2 μg/ml, hergestellt durch Insektenzellkultur). Das ICAM-1 fördert die Bildung eines engen Kontakts, indem es das Integrin LFA1 auf der T-Zelloberfläche bindet.
12. Alle Proteinmischungen werden in Blockpuffer eingelegt, gefolgt von einer Inkubation für 1 h bei RT oder mindestens 2 h bei 4 °C.
    Anmerkung: Die Moleküldichte auf solchen Oberflächen von ~8000 pro μm2 wurde bereits bestimmt. Angesichts der Tatsache, dass photoaktivierbares pMHC ~1/30 des biotinylierten Proteins auf der Oberfläche ausmacht, beträgt seine Dichte ~267 Moleküle pro μm2 vor dem Deaktivieren.
13. Waschen Sie wie in Schritt 1.6 und lassen Sie HBS bis zur Gebrauchsfertigkeit.
14. Geben Sie 200.000 CD4⁺- oder CD8⁺-T-Zellen, die den entsprechenden TCR exprimieren, in jede Vertiefung und lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 37 °C adhäsieren. Sobald sich die Zellen an der Oberfläche festgesetzt und ausgebreitet haben, sind sie bereit für die Photoaktivierung und Bildgebung.
    Anmerkung: Die retrovirale Transduktion von Effektor-T-Zellen mit fluoreszierenden bildgebenden Sonden wird an anderer Stelle ausführlich beschrieben. Die Kalzium-Signalübertragung kann auch mit nicht transduzierten T-Zellen untersucht werden, die mit dem kalziumempfindlichen Farbstoff Fluo-46 beladen sind. Der ratiometrische Farbstoff Fura-2 wird nicht empfohlen, da er eine Anregung im UV-Bereich erfordert, die auch eine Deaktivierung des photoaktivierbaren pMHC induziert.

>2. Bilderfassung

1. Verwenden Sie für die Bildaufnahme ein inverses TIRF-Mikroskop, das mit einer UV-kompatiblen 150-fach-Objektivlinse ausgestattet ist. UV-Bestrahlung benutzerdefinierter Bereiche mit einem digitalen Membransystem, das an eine 100-W-Quecksilberlampe (HBO) angeschlossen ist. Richten Sie das UV-Licht dieser Lampe mit einem 400-nm-Langpassspiegel auf die Probe.
2. Verwenden Sie Bildanalysesoftware für die lokalisierte Photoaktivierung und Zeitrafferaufnahme. In den meisten Experimenten werden Sonden sowohl im grünen als auch im roten Kanal mit 488-nm- bzw. 561-nm-Anregungslasern überwacht. Das Laserlicht wird mit Hilfe eines dichroitischen Doppelbandpassspiegels auf die Probe gelenkt, der auch im UV-Bereich transmittiert (um ein Deimaging zu ermöglichen). Weitere Informationen zur Mikroskopkonfiguration finden Sie in der Materialtabelle und in Abbildung 1.
3. Nachdem Sie den Objektträger mit den T-Zellen montiert haben, passen Sie die Einstellungen an, um bei Bedarf eine TIRF- oder Epifluoreszenzbeleuchtung zu erhalten. Wählen Sie im Live-Modus ein Feld von Zellen aus, die die interessierende(n) Fluoreszenzsonde(n) exprimieren. Etablieren Sie mikrometergroße Regionen für die Photoaktivierung unter einzelnen Zellen mithilfe der Softwaresteuerung.
4. Beginnen Sie mit der Erfassung des Zeitraffers. In der Regel werden 80 Zeitpunkte mit einem Intervall von 5 s zwischen den einzelnen Zeitpunkten erfasst. Damit bleibt mehr als genug Zeit für sequentielle Belichtungen von 488 nm und 563 nm bei Dual-Color-Experimenten.
5. Nach 10 Zeitpunkten photoaktivieren Sie die ausgewählten Regionen, indem Sie den digitalen Blendenverschluss für 1 - 1,5 s öffnen.
6. Wählen Sie nach Abschluss des Zeitraffers ein neues Zellenfeld aus und wiederholen Sie den Vorgang.

Ergebnisse

Abbildung 1: Mikroskopkonfiguration für Photoaktivierung und TIRF-Bildgebung.

488 nm und 561 nm Laser werden für die TIRF- und Epifluoreszenzbildgebung von grünen bzw. roten Sonden verwendet. Das UV-Licht für die Photoaktivierung wird von einer Quecksilberlampe (Hg) entnommen, die an ein digitales Membransystem angeschlossen ist, das in der Lage ist, kleine, benutzerdef...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nunc Lab-Tek Kammer-Deckglas	Thermofischer Scientific	155361
Poly-L-Lysinhydrobromid	Sigma-Aldrich	Nr. P2636	Es muss biotinyliertes Poly-L-Lysin hergestellt
EZ-Link NHS-Biotin	Thermofischer Scientific	20217	Es muss biotinyliertes Poly-L-Lysin hergestellt
Streptavidin	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500: BirA Biotin-Protein-Ligase-Standard-Reaktionskit	Begierde	BirA500	Wird zur Biotinylierung von Proteinen verwendet
Biotinyliertes Hb I-EK			Zur Proteinfaltung siehe Referenz 6. Verwenden Sie für die Biotinylierung das BirA-Kit
Biotinyliertes NPE-MCC I-EK	Anaspec		Custom NPE-MCC (HANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATKOH) kann bei Anaspec erworben werden
Biotinylierter αH2-Kk-Antikörper	BD Biowissenschaften	553591
Biotinylierte NPE-OVA H2-Kb	Anaspec		Benutzerdefinierte NPE-OVA (H-SIINFE- K(Nvoc)-L-OH) kann bei Anaspec erworben werden
Biotinyliertes KAVY H2-Db	Anaspec		Kundenspezifisch synthetisiertes Protein (KAVYDFATL) kann bei Anaspec erworben werden
Biotinyliertes ICAM1			Zur Proteinfaltung siehe Referenz im Protokoll. Verwenden Sie für die Biotinylierung das BirA-Kit
Tragbare UV-Lampe	UVP	UVGL-25	Die Lampe wird < 1 cm von der Probe entfernt gehalten. 30 s von 365 Licht sind ausreichend für das detektierbare Deaktivieren, 20 min für das quantitative Deaktivieren.
Olympus IX-81 OMAC TIRF-System.	Olymp		Weitere Informationen zum Bildgebungssystem finden Sie in Abbildung 6
Mosaik digitale Membran	Andor
Diabook-Software	Innovationen in der intelligenten Bildgebung