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>1. Präparation von humanen CD4+ Th1-Effektor-/Memory-T-Zellen
- Legen Sie ein Tourniquet auf den Arm des Spenders, wischen Sie die Vene mit Alkohol ab und führen Sie eine Nadel ein. Ziehen Sie langsam 15 ml Blut in einen Vacutainer mit EDTA als Antikoagulans. Wenn das Blut entnommen wurde, lösen Sie das Tourniquet, bevor Sie die Nadel entfernen. Üben Sie sofort Druck mit steriler Gaze auf die Wunde aus, wenn die Nadel entfernt wird.
- Übertragen Sie das Blut in ein 50-ml-Röhrchen. Geben Sie RPMI-1640 bei RT in einer Verdünnung von 1:1 (Endvolumen 30 ml). Das verdünnte Blut vorsichtig auf zwei 50-ml-Röhrchen mit 15 ml vorgefiltertem Lymphozyten-Isolationsmedium wie Ficoll-Paque bei RT auffüllen.
- Zentrifugieren Sie das Gradient bei RT für 30 min bei 1.200 x g in einem schwingenden Schaufelrotor. Während der Zentrifugation T-Zell-Medium (500 ml RPMI-1640, 50 ml FCS, 5 ml Penicillin/Streptomycin) vorbereiten.
- Wenn Sie das 50-ml-Röhrchen aus der Zentrifuge nehmen, beobachten Sie vier Schichten: ein Pellet aus roten Blutkörperchen im Boden, die Paque, eine Zellschicht, die weiße Blutkörperchen (einschließlich Lymphozyten) enthält, und das Plasma. Entfernen Sie vorsichtig die Schicht der weißen Blutkörperchen mit einer Pasteur-Pipette und geben Sie sie in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen.
- Waschen Sie die Schicht der weißen Blutkörperchen, indem Sie RT RPMI-1460 (bis zu 20 ml) hinzufügen und 5 Minuten lang bei RT bei 1.200 x g zentrifugieren. Resuspendieren Sie die weißen Blutkörperchen in 1 ml T-Zellmedium. 5 μl der 1 ml Zellsuspension in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit 250 μl T-Zellmedium geben und mit der Pipette vorsichtig auf und ab mischen.
- 25 μl verdünnte Zellsuspension zu 25 μl 0,4 % Trypanblau geben. Geben Sie 10 μl Mischung auf jede Seite eines Standard-Hämozytometers.
- Stellen Sie das Hämozytometer auf ein Lichtmikroskop mit geringer Leistung. Mit einem 10-fachen Objektiv wird die Anzahl der lebenden Zellen gezählt, die den Farbstoff Trypanblau ausgeschlossen haben und im mittleren Quadrat beider Seiten des Hämozytometers vorhanden sind.
- Um die Zellkonzentration zu berechnen, multiplizieren Sie den Durchschnitt der 2 Quadrate mit 100 (Verdünnungsfaktor) und multiplizieren Sie dann mit 104, um die Anzahl der Zellen/ml zu erhalten.
- Die Endkonzentration wird auf 0,5 x 106 Zellen/ml im T-Zell-Medium eingestellt. Geben Sie den Zellen eine Endkonzentration von je 1 μg/ml der bakteriellen Superantigene Staphylokokken-Enterotoxin B (SEB) und toxisches Schocksyndrom-Toxin 1 (TSST) zu. Kultur für 72 Stunden (37 °C und 5 % CO2), um die CD4+ T-Zellpopulation zu erweitern.
- T-Zellen (1.200 x g, 5 min) pelletieren und bei 0,5 x 106 Zellen/ml in T-Zell-Medium unter Zusatz von humanem IL-15 (20 ng/ml) resuspendieren. Lymphozyten in einen T150-Kolben übertragen. Expandieren/teilen Sie die Zellen weiterhin alle 24-48 Stunden in vollem Medium-IL-15 nach Bedarf (basierend auf der Medienfarbe; d.h. immer dann, wenn das Medium von rosa zu leicht gelb wechselt. Halten Sie die resultierende Lymphozytenpopulation bis zu 15 Tage lang aufrecht.
Anmerkung: Dieses Protokoll wird spezifisch eine Untergruppe von CD4+ T-Zellen aktivieren und erweitern, die auf SEB und TSST reagieren, und sie dann in Richtung eines Th1-ähnlichen Effektor-/Gedächtnisphänotyps treiben. Andere weiße Blutkörperchen überleben und wachsen unter diesen Bedingungen nicht, so dass die Zellen in Schritt 1.10 zu mindestens 95 % CD4+, CD45RO+ T-Zellen sind, wie leicht durch Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. Falls gewünscht, kann eine weitere Aufreinigung problemlos durch kommerziell erhältliche Positiv- oder Negativ-Selektionskits auf Antikörper-/Magnetbead-Basis erreicht werden.
>2. Starten der primären humanen Endothelzellkultur
- Ein T25-Kolben wird unter sterilen Bedingungen mit Fibronektin (FN) 20 μg/ml in PBS bestreicht. 30-60 Minuten bei RT stehen lassen. Entfernen Sie FN und fügen Sie 5 ml vollständiges Medium hinzu (endotheliales Basalmedium (EBM-2), ergänzt mit endothelialem Wachstumsmedium (EGM-2) Singlequots). In einem 37 °C heißen Zellkultur-Inkubator für mindestens 30 min vorinkubieren.
- Tauen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen humanen Lungen- oder dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (HLMVECs oder HDMVECs) in einem 37 °C warmen Wasserbad unter gelegentlichem sanftem Rühren für ~2-3 min auf. Übertragen Sie die Zellen sofort in den T25-Kolben mit dem vorgewärmten Medium. Vorsichtig schwenken und in einen Inkubator bei 37 °C stellen.
- Wechseln Sie das Medium nach ~4-6 Stunden. Wechseln Sie das Medium etwa alle 48 Stunden (oder wenn das Medium leicht gelb wird), bis die Platte eine Konfluenz von ~90-95 % erreicht.
>3. Allgemeine Teilung und Expansion von Endothelzellen
- Züchten Sie Zellen auf ~90-95 Konfluenz. Dies kann 2-5 Tage dauern. Zum Spalten das Medium entfernen und mit PBS spülen. PBS entfernen und durch ein Mindestvolumen von frischem 1x Trypsin (0,5 ml für T25 oder 1,5 ml für T75) ersetzen. Vorsichtig schwenken, um alle Oberflächen mit Trypsin zu bedecken. Inkubieren Sie bei 37 °C für ~5 min. Überwachen Sie die Ablösung der Zellen von der Platte mit einem Lichtmikroskop mit geringer Leistung.
- Wenn die Mehrzahl der Zellen abgerundet oder abgelöst erscheint, fügen Sie 5 Volumina (d. h. im Vergleich zum hinzugefügten Trypsinvolumen) vorgewärmtes vollständiges EGM-2-Medium hinzu und pipettieren Sie vorsichtig über die Oberfläche des Kolbens, um alle Zellen zu lösen.
- Endothelzellen werden mit einem Hämozytometer gezählt, wie in 1.6-1.7 beschrieben. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation (5 min, 1.200 x g). Entfernen Sie den Überstand. Passen Sie die Konzentration auf 0,5 Millionen Zellen pro ml an, indem Sie vorgewärmtes vollständiges EGM-2 MV-Medium hinzufügen.
- Die Aliquote der Zellen werden zur Wartung in die entsprechenden FN-beschichteten Schalen oder Kolben überführt. Vorsichtig schwenken und in den Inkubator stellen. Wechseln Sie das Medium innerhalb von 6 bis 12 Stunden nach dem Plattieren. Das Medium sollte danach etwa alle 48 Stunden gewechselt werden.
>4. Transfektion von Endothelzellen
HINWEIS: Primäre Endothelzellen sind refraktär gegenüber der Transfektion mit den gebräuchlichsten chemischen und Elektroporationsmethoden. Die im Folgenden beschriebene nukleäre Transfektionsmethode ermöglicht eine relativ hohe Transfektionseffizienz (~50-70%). Eine wirksame alternative Methode ist die Verwendung einer Infektion durch geeignete virale Vektoren (siehe Anmerkungen in der Materialtabelle).
- Bereiten Sie T25- oder T75-Kolben (je nach Bedarf) mit HLMVECs oder HDMVECs bis zu einer Enddichte von 90-95 % Konfluenz vor. Beschichten Sie mit Fibronektin (FN) 20μg/ml in PBS unter sterilen Bedingungen entweder Mikroskopkulturplatten wie Delta-T-Platten (für Schritt 5) oder kreisförmige 12-mm-Glasdeckgläser, die in einer Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte (für Schritt 6) platziert werden, wie oben beschrieben (2.1).
- Geben Sie 1 ml des vollständigen EGM-2-Nährmediums in die Mikroskopkulturplatten oder 0,5 ml in jede 24-Well-Platte und äquilibrieren Sie die Platten in einem befeuchteten 37 °C/5 % CO2 -Inkubator.
- Entnahme und Zählung von Endothelzellen wie in den Schritten 3.1-3.3. Das erforderliche Zellvolumen (0,5 Millionen Zellen pro Probe) wird bei 1.200 x g für 5 Minuten bei RT zentrifugiert. Das Zellpellet wird vorsichtig in 100 μl RT-Kerntransfektionslösung pro Probe resuspendiert.
- Kombinieren Sie 100 μl Zellsuspension mit 1-5 μg DNA. Zell-/DNA-Suspension in eine zertifizierte Küvette überführen; Die Probe muss den Boden der Küvette ohne Luftblasen bedecken.
HINWEIS: Konstrukte, die auf YFP oder DsRed auf die Zellmembran abzielen (über die N-terminalen 20 Aminosäuren des Neuromodulins, das ein Signal für die posttranslationale Palmitoylierung enthält), wurden allein verwendet (Membran-YFP allein oder Membran-DsRed allein) oder mit einem zytoplasmatischen volumetrischen Marker (z. B. Membran-YFP und lösliches DsRed) co-transfiziert. Viele Permutationen von fluoreszierenden Proteinmarkern können verwendet werden.
- Verschließen Sie die Küvette mit der Kappe. Die Küvette mit der Zell-/DNA-Suspension in den Küvettenhalter des Elektroporators einführen und das Elektroporationsprogramm S-005 anwenden. Nehmen Sie die Küvette aus dem Halter, sobald das Programm beendet ist.
- Geben Sie ~500 μl des voräquilibrierten Nährmediums in die Küvette und entfernen Sie die Zellsuspension vorsichtig aus der Küvette mit den Kunststoff-Transferpipetten, die im Kerntransfektionskit enthalten sind.
- Bei Experimenten mit einem Mikroskop verteilen Kulturplatten die Zellsuspension aus einer Reaktion gleichmäßig auf zwei Schalen mit vorgewärmtem Medium (Schritte 4.2-4.3). Bei Experimenten mit 24 Vertiefungen/Platten wird eine Reaktion gleichmäßig auf 3 Vertiefungen aufgeteilt.
- Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten 37 °C/5 % CO2 -Inkubator und wechseln Sie das Medium 4-6 Stunden und erneut 12-16 Stunden nach der Transfektion.
>5. Bildgebung und Analyse lebender Zellen
- Aufbereitung des Endothels
- Tag 0: Co-transfektive primäre HLMVECs mit Membran-YFP und löslichem DsRed über eine Nukleofektionstechnologie, wie in Schritt 4 beschrieben, und Platte auf lebende zellbildgebende Kulturplatten.
- Tag 1: Ersetzen Sie das Medium durch ein frisches Medium, das IFN-γ (100 ng/ml) enthält, um die MHC-II-Expression zu induzieren. An Tag 2. Stimulieren Sie transfizierte Zellen durch Zugabe von 20 ng/ml TNF-α zu den vorhandenen Medien.
- An Tag 3 inkubieren Sie das Endothel mit je 1 μg/ml bakteriellen Superantigenen Staphylokokken-Enterotoxin B (SEB) und toxischem Schocksyndrom-Toxin 1 (TSST) bei 37 °C für 30-60 Minuten unmittelbar vor den Experimenten. Lassen Sie diesen Schritt für '-Ag'-Steuerungsbedingungen aus.
- Aufbereitung von Lymphozyten
- Parallel zu Schritt 5.1.3 Puffer A (phenolrotfreies HBSS) mit 20 mM HEPES, pH 7,4 und 0,5 % vol humanem Serumalbumin, das auf 37 °C vorgewärmt wurde, vorbereiten. Entnehmen Sie eine Probe von kultivierten Lymphozyten und bestimmen Sie die Dichte durch Zählung mit einem Hämozytometer (Schritt 1.12-1.17).
- Zentrifugieren Sie 2 Millionen Zellen pro Probe bei 1.200 x g für 5 min bei RT in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 2 ml Puffer A, so dass keine Zellcluster zurückbleiben.
- Entfernen Sie ein frisches Aliquot des Fura-2-Calciumfarbstoffs und resuspendieren Sie es in DMSO, um eine Stammkonzentration von 1 mM zu erreichen.
- Geben Sie 2 μl Fura-2-Stammlösung in die T-Zell-Suspension (2 μM Endkonzentration), verschließen Sie das Röhrchen und mischen Sie sofort, indem Sie das Röhrchen umdrehen, um eine gleichmäßige Verteilung des Farbstoffs zu gewährleisten. Bei 37 °C 30 min inkubieren.
- Zentrifugieren Sie wie in Schritt 5.2.2. Aspirieren Sie Buffer-A und resuspendieren Sie die Lymphozyten sanft, aber gründlich in 20-40 μl frischem Buffer-A.
- Einrichtung und Erfassung der Bildgebung lebender Zellen
HINWEIS: Eine Vielzahl von Systemen kann für die Fluoreszenzbildgebung lebender Zellen an aufrechten und inversen Lichtmikroskopen eingesetzt werden. Zu den Grundanforderungen gehören eine Fluoreszenzlichtquelle und Filter, eine CCD-Kamera, eine motorisierte Filterumschaltung und Verschlüsse, ein beheizter Tisch (oder eine am Mikroskop montierbare beheizte Kammer) sowie Software für die automatische Bildaufnahme. Für dieses Protokoll sind Ölimmersionslinsen mit hoher numerischer Apertur und hoher Vergrößerung (z. B. 40X, 63X) erforderlich, um die erforderliche räumliche Auflösung zu erreichen. Besondere Sorgfalt ist bei der Auswahl der geeigneten Fluoreszenzquelle und der Linsen für die Fura-2-basierte Calcium-Bildgebung geboten, da nicht alle mit den erforderlichen Anregungswellenlängen von 340/380 nm kompatibel sind. Ein alternativer Ansatz (kompatibel mit Standard-grünen und roten Fluoreszenzfiltersets) kann mit nicht-ratiometrischen kalziumempfindlichen Farbstoffen (z. B. Fluo-4, Rhod-3) verwendet werden, obwohl diese den Kalziumfluss nicht genau quantifizieren können und nur eine relative/quantitative Ablesung liefern.
- Schalten Sie das Mikroskopsystem ein (PC für die Bedienung, Mikroskop, CCD-Kamera, Filterrad und Xenonlampe).
- Öffnen Sie die entsprechende Software.
- Richten Sie ein Mikroskop/Software für die automatisierte Mehrkanal-Zeitrafferbildgebung ein. Dazu gehören die sequentielle Erfassung eines differentiellen Interferenzkontrasts (DIC), einer standardmäßigen grünen Fluoreszenz, einer standardmäßigen roten Fluoreszenz und standardmäßiger 340- und 380-nm-Anregungsbilder. Legen Sie das Intervall für die Erfassung auf 10-30 Sekunden und eine Gesamtdauer von ~20-60 Minuten fest.
- Legen Sie die Belichtungszeiten für die Fura-2-Bildgebung fest.
- Geben Sie frisches Objektivöl hinzu und montieren Sie eine Mikroskopschüssel mit nur 0,5 ml Puffer-A auf den Heiztischadapter und schalten Sie ihn sofort ein, um ihn auf 37 °C auszugleichen (dauert ~2-3 Minuten).
- Legen Sie ruhende Fura2-beladene Lymphozyten mit einer 20-μl-Pipette in die montierte Mikroskopschalenkammer.
- Aktivieren Sie die Hellfeld-Bildgebung. Wählen Sie den Lichtweg zu den Okularen. Verwenden Sie den groben Fokusknopf, um das Objektiv mit dem Boden der Mikroskopschüssel in Kontakt zu bringen. Verwenden Sie das Okular und den Feinfokussierknopf, um auf die T-Zellen zu fokussieren, die sich am Boden der Schale befinden.
- Verwenden Sie die Steuerelemente für die X-y-Phase, um ein Feld mit mindestens 10 Zellen auszuwählen. Vermeiden Sie überfüllte Felder und Zellklumpen, da diese zu bildgebenden Artefakten führen.
- Wechseln Sie von einer Hellfeld- zu einer fluoreszierenden Lichtquelle. Wechseln Sie von der Okularabbildung zur CCD-Kamera. Legen Sie die Erfassungsparameter fest (z. B. Belichtungszeit, Detektorverstärkung und Binning). Mit der Software können Sie ruhende Bilder der Fura2-340 und Fura2-380 aufnehmen (beginnend mit jeweils identischer Belichtungszeit, normalerweise im Bereich von ~200-1.000 ms).
- Verwenden Sie die in Schritt 5.4.1 beschriebenen Methoden, um Fura2-340/Fura2-380 für jeden Lymphozyten zu berechnen. Führen Sie wiederholte Iterationen durch, um die Belichtungszeiten der Fura2-340 und Fura2-380 anzupassen, Bilder aufzunehmen und Verhältnisse zu berechnen, bis die Durchschnittswerte nahe 1 liegen.
- Legen Sie die Belichtungszeiten für mem-YFP und DsRed fest.
- Die in Schritt 5.3.3.1 verwendete Mikroskopschale ist durch eine Mikroskopschale zu ersetzen, die transfizierte, aktivierte und SAg-behandelte (oder unbehandelte; Kontroll-) HLMVECs oder HDMVECs aus dem Zellkulturinkubator enthält (Schritte 4.5.1). Verwenden Sie eine Einweg-Transferpipette, um das Medium schnell zu entfernen, spülen Sie einmal die Zugabe von ~1 ml vorgewärmtem Puffer-A. Aspirieren und dann 0,5 ml Puffer-A hinzufügen.
- Identifizieren Sie Felder, in denen hell fluoreszierende positive transfektante Endothelzellen vorhanden sind und gesund mit gut ausgebildeten interzellulären Verbindungen erscheinen.
- Passen Sie die Erfassungsparameter (z. B. Belichtungszeit, Detektorverstärkung und Binning) für mem-YFP und DsRed an. Stellen Sie sicher, dass die mittlere Fluoreszenzsignalintensität in jedem Kanal zwischen 25 % und 75 % des Dynamikbereichs des Detektors liegt.
- Durchführung von Experimenten zur Bildgebung lebender Zellen.
- Verwenden Sie automatisierte Software, um mit der Bilderfassung zu beginnen, und erfassen Sie mehrere Bildintervalle, um eine Ausgangsbasis zu erstellen.
- Während der Aufnahme ~5 μl konzentrierte Fura-2-beladene Lymphozyten (aus Schritt 5.2) in die Mitte des Bildgebungsfeldes der Mikroskopschale geben, indem die Spitze einer Pipette mit kleinem Volumen (P-5 oder P-20) in das Medium nahe der Mitte des Objektivs eingeführt und langsam ausgestoßen wird.
- Wenn sich die Lymphozyten im Bildgebungsfeld eingenisten, nehmen Sie feine Anpassungen im Fokus vor, um sicherzustellen, dass die Schnittstelle zwischen T-Zellen und Endothelzellen (immunologische Synapsen) in der Fokusebene bleibt. Mit 40- und 63X-Objektiven sind ~10-20 Zellen pro Feld optimal. Werden weniger Zellen im Bildgebungsfeld beobachtet, wiederholen Sie Schritt 5.3.4.2.
- Nachdem das gewünschte Beobachtungsintervall des Experiments abgeschlossen ist, wird die Bildgebung fortgesetzt und Ionomycin sofort direkt in die Mikroskopschale pipettiert (unter Verwendung der Technik wie in 5.3.4.2) auf eine Endkonzentration von 2 μM, um einen maximalen Kalziumfluss/Fura-2-Signalweg zu induzieren (d. h. ein Mittel zur Kalibrierung, siehe Analyse 5.4.).