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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Transgenes Mausmodell der Brustkrebsentstehung
- Beobachten Sie Mäuse aus dem gewünschten Krebsmodell auf das entsprechende Tumorwachstum mittels Palpation oder Messschiebermessung, bevor Sie fortfahren.
Anmerkung: Hier wurde das transgene Mausmodell der Brustkrebsentstehung (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT) verwendet. Diese Tiere entwickeln spontan invasive Mammakarzinome im Alter von 6 bis 12 Wochen in jeder Brustdrüse. Normale Brustdrüsen wurden als Kontrollen von den transgennegativen, altersgleichen Wurfgeschwistern verwendet.
2. Intravenöse Injektion von spezifischen und unspezifischen Antikörpern
- Reinigen Sie Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper B7-H3 und Kaninchen-Immunglobulin G (IgG)-Kontrollantikörper auf einer Entsalzungssäule (z. B. PD-10), um Konservierungsstoffe und Lagerpuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers zu entfernen.
Anmerkung: Einige Antikörper müssen möglicherweise mit einem Protein-A-Agarose-Kügelchen-basierten Protokoll weiter gereinigt werden.
- Aliquote Dosierungen von 33 μg jedes Antikörperkonjugats in einzelnen Mikrozentrifugenröhrchen.
Anmerkung: Die Dosierung des verabreichten Mittels kann je nach Anwendung variieren und entspricht den Dosierungen, bei denen das Antikörperkonjugat routinemäßig verwendet wird. Die Konzentration der Antikörperlösungen ist aus Gründen der Tiersicherheit erforderlich, wenn das Volumen mehr als 100 μl beträgt.
- Zum gewünschten Zeitpunkt vor der Gewebeentnahme, hier 96 h, wird das tumortragende Tier mit 2% sauerstoffströmendem Isofluran bei 2 l/min betäubt und auf einen 37 °C beheizten Tisch gestellt. Kneifen Sie in die Zehen, um sicherzustellen, dass vor dem Eingriff das richtige Anästhesieniveau erreicht wurde.
- Zur Vorbereitung der Schwanzvenenimpfung der Antikörperlösungen desinfizieren Sie den Schwanz des Tieres, indem Sie ihn dreimal mit einem Alkoholtupfer abwischen. Erweitern Sie die Schwanzvenen, indem Sie sie etwa 30 Sekunden lang mit einem Wärmekissen erwärmen. Vermeiden Sie es, das gesamte Tier zu erhitzen. Wischen Sie den Schwanz noch einmal mit einem Alkoholtupfer ab, nachdem Sie das Heizkissen entfernt haben.
- Führen Sie mit einem 27G-Schwanzvenenkatheter die Schmetterlingsnadel in eine der beiden seitlichen Schwanzvenen ein und fixieren Sie den Schwanz vorsichtig mit der eingeführten Nadel mit einem Stück chirurgischem Klebeband auf der Bühne.
Anmerkung: Ein sichtbarer Blutrückfluss in den Katheter zeigt die richtige Position der Nadel in der Schwanzvene an.
- Spülen Sie den Katheter mit 25 μl steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und injizieren Sie dann die Antikörperlösung mit Insulinspritzen in den Katheter. Spülen Sie den Katheter erneut mit 25 μl sterilem PBS.
- Entfernen Sie die Nadel vom Schwanz und üben Sie Druck aus, um die Blutung zu stoppen.
- Schalten Sie die Anästhesie aus und beobachten Sie das Tier, bis es vollständig wach ist, auf Anzeichen von Beschwerden.
>3. Entnahme und Aufbereitung von Zieltumorgeweben
- Zum gewünschten Zeitpunkt das Tier gemäß dem akzeptablen institutionellen Verfahren human einschläfern, hier durch allmähliches Einatmen von 100 % CO2 aus einem Druckgastank mit einer Verdrängungsmenge von 10-30 % Volumen/min.
Anmerkung: Einige Anwendungen der IVIL-Technik erfordern eine Euthanasie durch Herzperfusion mit PBS, um frei zirkulierende Antikörper zu entfernen.
- Nach Bestätigung der humanen Euthanasie durch Einstellung der Atem- und Herzbewegungen, fehlender Zehenkneifreaktion und Vergrauung der Schleimhäute wird das Tumorgewebe mit einer chirurgischen Schere und Pinzette wie folgt entfernt:
- Legen Sie die Maus in Rückenlage und fassen Sie mit einer Pinzette nur die äußere Hautschicht zwischen den Brustdrüsen, die dem Schwanz am nächsten sind (5.), und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen kleinen Schnitt.
- Führen Sie die geschlossene Schere in den Schnitt ein und öffnen Sie langsam die Spitze, um die Haut vorsichtig von der darunter liegenden Bauchwandmembran zu trennen und sie intakt zu halten.
- Machen Sie einen vertikalen Schnitt am Bauch und trennen Sie die Haut weiter von der inneren Membran. Machen Sie zwischen der 3. und 4. Brustdrüse einen horizontalen Schnitt quer über den Bauch, um das Zurückziehen der Haut und die Visualisierung der Brustdrüsen zu ermöglichen.
Anmerkung: Brusttumoren und -drüsen befinden sich oberflächlich unter der Haut.
- Fassen Sie jeden Tumor oder jede normale Drüse mit einer Pinzette an und schneiden Sie die anhaftende Haut vorsichtig mit einer chirurgischen Schere ab.
- Legen Sie herausgeschnittene Taschentücher in Einweg-Basisformen, die voretikettiert und mit Einbettmedium für optimale Schnitttemperatur (OCT) gefüllt sind, und frieren Sie die Formen schnell ein, indem Sie sie auf Trockeneis legen. Um die Off-Target-Verabreichung zu untersuchen, entfernen Sie andere Gewebe oder Organe von Interesse (z. B. Leber oder Lunge).
Anmerkung: Um das Protokoll an dieser Stelle zu unterbrechen, lagern Sie gefrorene Gewebeblöcke bei -80 °C, bis Sie fortfahren können.
- Mit einem Kryostaten werden gefrorene Gewebeblöcke mit einer Dicke von 10 μm geschnitten und benachbarte Schnitte auf vorbeschriftete Adhäsionsglasobjektträger gelegt.
Anmerkung: Um das Protokoll an dieser Stelle zu unterbrechen, lagern Sie die Objektträger bei -80 °C, bis Sie fortfahren können.
>4. Ex-vivo-Färbeprotokoll
HINWEIS: Für den quantitativen Vergleich zwischen Fluoreszenzmikroskopie-Bildern werden alle Objektträger gleichzeitig mit den gleichen vorbereiteten Lösungen gefärbt.
- Spülen Sie gefrorene Gewebeobjektträger 5 Minuten lang mit PBS bei Raumtemperatur aus, um OCT zu entfernen.
- Trennen Sie Gewebeschnitte mit einem hydrophoben Barrierestift, um das Volumen der während der Färbung benötigten Lösungen zu reduzieren.
Anmerkung: Achten Sie darauf, dass der Pen nicht über die Gewebeproben läuft, da dies entweder das Gewebe vom Objektträger entfernen oder eine ordnungsgemäße Färbung des betroffenen Gewebeteils verhindern kann. Lassen Sie die Gewebeabschnitte an keiner Stelle austrocknen.
- Fixieren Sie die Gewebeschnitte mit 4%iger Paraformaldehydlösung für 5 min.
- Spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in PBS.
- Permeabilisieren Sie Gewebeschnitte mit 0,5 % Triton-X 100 in PBS für 15 min.
- Spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in PBS.
- Blockieren Sie das Gewebe mit 3 % w/v Rinderserumalbumin (BSA) und 5 % v/v Ziegenserum, beide in PBS (Blockierungslösung) für 1 h bei Raumtemperatur.
Anmerkung: Passen Sie das Serum der Blockierungslösung an das Sekundärantikörper-Wirtstier an.
- Spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in PBS.
- Inkubieren Sie die Schnitte nach Wunsch mit primären Antikörpern, möglicherweise einem gemeinsamen nukleären (z. B. DAPI), vaskulären (z. B. CD31) oder zytoplasmatischen Marker (z. B. Aktin). Hier wurde Ratten-Anti-Maus-CD31 (Gefäßmarker) in einer Verdünnung von 1:100 gemäß den Herstellerangaben in der Blockierlösung über Nacht bei 4 °C vor Austrocknung geschützt auf einem Objektträgertablett verwendet.
Anmerkung: Fügen Sie keinen zusätzlichen primären Antikörper oder Antikörperkonjugat hinzu. Das Konjugat, das injiziert wurde und sich in vivo im Gewebe ansammeln konnte, fungiert als primärer Antikörper.
- Spülen Sie die Objektträger dreimal 5 Minuten lang in PBS und wechseln Sie den PBS jedes Mal.
- Inkubieren Sie Objektträger mit Sekundärantikörpern, um Primärantikörper zu markieren. Für diese Anwendung visualisieren Sie den Anti-B7-H3-Antikörper mit dem konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper AlexaFluor-546 (1:200 Verdünnung, optimiert gemäß den Herstellerangaben) und CD31 mit dem AlexaFluor-488 Anti-Ratten-Sekundärantikörper (1:200 Verdünnung, optimiert gemäß den Anweisungen des Herstellers) in einer vor Licht und Dehydrierung geschützten Blockierungslösung auf einem Objektträger für 1 h bei Raumtemperatur.
Anmerkung: Sekundärantikörper stammen vom selben Wirtstier, entsprechen aber der Affinität der Sekundärantikörper zur Wirtsspezies des jeweiligen Primärantikörpers. Ab diesem Zeitpunkt sind die Dias vor Licht geschützt.
- Spülen Sie die Objektträger dreimal 5 Minuten lang in PBS und wechseln Sie den PBS jedes Mal.
- Tragen Sie einen Tropfen des Eindeckmediums in die Mitte der Gewebescheibe auf und platzieren Sie vorsichtig ein Deckglas, um das Einschließen von Luftblasen zu vermeiden.
- Die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack versiegeln und trocknen lassen.
Anmerkung: Um das Protokoll zu diesem Zeitpunkt bis zu einer Woche lang zu unterbrechen, lagern Sie die Objektträger bei -20 °C, bis Sie fortfahren können.
>5. Konfokalmikroskopische Bildgebung und quantitative Bildanalyse
HINWEIS: Die Vorbereitung des Konfokalmikroskops und der Bildgebungsparameter hängt vom verwendeten Konfokalsystem ab. Das hier verwendete Mikroskop wurde kommerziell erworben (z.B. Zeiss LSM 510 Meta System) und die dazugehörige Erfassungssoftware verwendet (z.B. Zen 2009). Viele dieser Schritte gelten jedoch für jedes konfokale Mikroskop und setzen grundlegende Kenntnisse in der konfokalen Mikroskopie voraus.
- Nachdem das System eingeschaltet und aufgewärmt wurde, wählt man das gewünschte Objektiv aus, hier wurde ein 20-faches (numerische Apertur = 0,8) Objektiv verwendet.
- Laden Sie einen positiven Steuerschieber mit dem Deckglas nach unten, um die Optimierung für das hellste Signal einzustellen. Bildgebung im roten Kanal, fokussieren Sie das System auf die Probe im Live-Bildgebungsmodus.
- Optimieren Sie für jeden verwendeten Laserkanal die Laserintensität, die Master-Verstärkung und die Lochblendengröße wie folgt:
- Wechseln Sie für die Bildgebung in den kontinuierlichen Modus.
- Optimieren Sie die Schieberegler "Laserintensität" (die die Laserleistung steuert) und "Verstärkung" (Master) (die die Spannung für die Photomultiplier-Röhre steuert), während Sie das LUT-Histogramm (Look Up Table) überwachen. Passen Sie diese beiden Einstellungen an, bis der Dynamikbereich des Histogramms ohne Sättigung der Pixel gefüllt ist.
Anmerkung: Wenn die Laserintensität zu hoch ist, kommt es zu Photobleaching. Wenn der Gain (Master) zu hoch ist, wird das Bild verrauscht. Im Idealfall liegt der Gain (Master) in der Mitte seines Bereichs.
- Stellen Sie die Lochblende auf 1 luftige Einheit (AU) ein, was die höchste Auflösung und die dünnste Z-Schicht ergibt.
- Schieben Sie die Leiste "Digitaler Offset", um das Grundrauschen im LUT-Histogramm zu minimieren und einen echten schwarzen Hintergrund zu erhalten.
Anmerkung: Sobald die Mikroskopieeinstellungen für jeden Laserkanal und jedes Objektiv optimiert sind, halten Sie sie während der gesamten Bildgebungssitzung und für die Bildgebung aller Objektträger konstant, um den quantitativen Vergleich zwischen den Objektträgern zu ermöglichen.
- Wählen Sie auf der Registerkarte Erfassungsmodus unter Mittelwertbildung die gewünschte Anzahl und Bittiefe aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Optimal, um die optimale Pixelgröße festzulegen.
- Verwenden Sie die Schaltfläche Snap Acquisition, um ein Bild in hoher Qualität aufzunehmen. Hier wurden zufällige Sichtfelder aus dem Inneren des Tumors ausgewählt, aber auch andere Interessengebiete können für unterschiedliche Anwendungen zutreffen (Gefäße, Tumorränder, Eindringtiefe usw.).
- Speichern Sie Bilddateien in dem Format, das von der konfokalen Software (hier ".lsm") für die Offline-Verarbeitung und Quantifizierung verwendet wird.
Anmerkung: Wenn nicht alle Objektträger während derselben Sitzung abgebildet werden, speichern Sie die Einstellungen und laden Sie sie bei späteren Besuchen erneut, obwohl es aufgrund von Photobleaching nicht empfohlen wird, denselben Objektträger erneut abzubilden.
- Führen Sie die quantitativen Fluoreszenzintensitätsmessungen durch. Öffnen Sie Fiji (Fiji Is Just ImageJ software) und laden Sie eine .lsm-Bilddatei, indem Sie sie in die Statusleiste ziehen.
- Teilen Sie die Farbkanaldaten auf. Wechseln Sie zu Bild-> Stapel > Geteilte Kanäle.
- Bearbeiten Sie die Fluoreszenzbilder nach Bedarf vor, d.h. subtrahieren Sie das Hintergrundsignal (Process > Subtract Background) oder reduzieren Sie das Rauschen über eine Filtermethode.
- Segmentieren Sie den Farbkanal, der dem Referenzprotein entspricht (vaskuläre, nukleäre, zelluläre Färbung), indem Sie einen Schwellenwert für die Signalintensität festlegen (Bild > Anpassen > Schwellenwert).
Anmerkung: Manuelles Thresholding bringt Subjektivität in die Bildanalyse, daher macht die Verwendung eines automatisierten Thresholding-Algorithmus oder die Referenzierung von Bildhistogrammen die Ergebnisse der Bildanalyse weniger verzerrt.
- Verwenden Sie diesen Schwellenwert, um eine Binärmaske zu erstellen (Verarbeiten > Binärmaske > In Maske konvertieren).
- Messen und beschriften Sie ROIs innerhalb der Maske (Analysieren > Partikel analysieren > Aktivieren Sie Zu Manager hinzufügen > OK).
- Wenden Sie ROIs auf den Farbkanal an, der dem interessierenden Antikörper entspricht (Klicken Sie auf das Kanalbild, >Tools analysieren > ROI-Manager > Messen). Dadurch werden die ROIs der Maske auf das Antikörperbild angewendet und Bildmessungen für Markierungsabschnitte im Ergebnisfenster bereitgestellt. Fenster Ergebnisse speichern (Datei > Speichern).
- Berechnen Sie die gewünschte Statistik, z. B. die mittlere Fluoreszenzintensität, wie hier beschrieben.
- Führen Sie alle Verarbeitungsschritte identisch mit jedem Bild innerhalb einer Reihe von Folien aus. Erstellen Sie ein Makro, um dies automatisch für große Bildstapel zu tun.
- Damit das Bild erst nach quantitativen Messungen angezeigt wird, wenden Sie qualitative Bildanpassungen an, um die Visualisierung von Bioverteilungsmustern zu optimieren, indem Sie Minimum, Maximum, Helligkeit und Kontrast auf allen Objektträgern auf die gleichen Werte einstellen (Bild > Helligkeit/Kontrast > anpassen).
- Konvertieren Sie den Bildtyp (Bildtyp > > RGB-Farbe) und speichern Sie Dateien in einem verlustfreien Bildtyp wie z. B. .tiff (Datei > Speichern unter > Tiff...), um ihn in Präsentationen und Publikationen zu verwenden.