Ein Bead-basierter Multiplex-Immunoassay zur Identifizierung von erregerspezifischen Antikörpern im Speichel

Abstract

Quelle: Augustine, S. A. J., et al. Entwicklung eines Speichel-Antikörper-Multiplex-Immunoassays zur Messung der Exposition des Menschen gegenüber Umweltpathogenen. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video demonstriert eine Bead-basierte Multiplex-Immunoassay-Technik zum gleichzeitigen Nachweis von Antikörpern gegen mehrere Umweltpathogene im menschlichen Speichel. Fluoreszierende Kügelchen wurden an Antigene verschiedener Erreger gekoppelt, die mit Hilfe von Antikörpern in der menschlichen Speichelprobe eingefangen wurden. Nach der Markierung der Antikörper mit einem fluoreszierenden Reporter wurden die Kügelchen mittels Durchflusszytometrie analysiert, um das Vorhandensein verschiedener erregerspezifischer Antikörper im Speichel zu beurteilen.

Protocol

>1. Wulst-Kupplung

1. Koppeln Sie die Antigene mit den in Tabelle 1 gezeigten Konzentrationen an die Bead-Sets.
2. Fügen Sie jedes Antigen zu den aktivierten Kügelchen hinzu und bringen Sie das Gesamtvolumen auf 500 μl in 50 mM MES, pH 5,0. Mischen Sie die Antigene und Kügelchen mit einem Vortex.
3. Inkubieren Sie die Antigene und Kügelchen 2 Stunden lang durch Mischen durch Rotation (~15 U/min) bei Raumtemperatur im Dunkeln. Pelletieren Sie die gekoppelten Kügelchen durch Mikrozentrifugation bei 10.000 x g für 2 min.
4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Kügelchen in 500 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)-Rinderserumalbumin (BSA)-Polyoxyethylen-Sorbitanmonolaurat (Tween-20)-Natriumazid (PBS-TBN) mit einem pH-Wert von 7,4 durch Vortex und Ultraschall. Die Kügelchen werden durch Mikrozentrifugation bei 10.000 x g für 2 min pelletiert und der Überstand entfernt.
   Vorsicht: Natriumazid ist eine akut giftige Chemikalie. Es ist tödlich, wenn es verschluckt wird oder mit der Haut in Berührung kommt. Atmen Sie keinen Staub/Dämpfe/Gas/Nebel/Dämpfe oder Spray ein. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), wenn Sie sie in Übereinstimmung mit den geltenden Gesetzen handhaben und entsorgen.
5. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 1 ml PBS-TBN durch Vortex und Beschallung für 20 Sekunden.
6. Pelletieren Sie die Kügelchen durch Mikrozentrifugation bei 10.000 x g für 2 min.
7. Wiederholen Sie die Schritte 1.5 und 1.6.
   Anmerkung: Damit sind insgesamt zwei Wäschen mit PBS-TBN verfügbar.
8. Resuspendieren Sie die gekoppelten und gewaschenen Kügelchen in 1 ml PBS, 1 % BSA, 0,05 % Azid, pH 7,4. Lagern Sie die gekoppelten Kügelchen in einem Kühlschrank bei 2-8 °C im Dunkeln.

>2. Speichel-Multiplex-Immunoassay

1. Nehmen Sie den Speichel aus dem -80 °C heißen Gefrierschrank und lassen Sie ihn bei Raumtemperatur auftauen.
2. Resuspendieren Sie antigengekoppelte Kügelchen durch Vortex und Beschallung für 20 Sekunden.
3. Bereiten Sie eine Arbeitsbead-Mischung vor, indem Sie die gekoppelten Bead-Materialien auf eine Endkonzentration von 100 Beads/μl jedes einzelnen Bead-Sets in PBS-1 % BSA-Puffer verdünnen.
4. Bereiten Sie eine 1:4-Verdünnung des Speichels mit PBS-1 % BSA-Puffer in einer 96-Well-Deep-Well-Platte vor.
5. Die Filterplatte mit 100 μl Waschpuffer vorbefeuchten und den Überstand durch Vakuum entfernen.
6. Geben Sie 50 μl einer Arbeitsperlenmischung und ein gleiches Volumen verdünnten Speichels in 95 Vertiefungen der 96-Well-Filterplatten für eine abschließende Verdünnung von 1:8. Mischen Sie Reaktionen mit einer Mehrkanalpipette. In die eine Kontrollvertiefung werden 50 μl antigengekoppelte Kügelchen plus 50 μl PBS-1 % BSA-Puffer (als Ersatz für Speichel) gegeben.
7. Abdecken und im Dunkeln bei Raumtemperatur 1 Stunde auf einem Mikrotiterplatten-Shaker bei 500 U/min inkubieren lassen. Überstand durch Vakuum entfernen. Die Vertiefungen werden mit 100 μl Waschpuffer gewaschen und der Überstand durch Vakuum entfernt. Waschen 1x wiederholen.
8. Resuspendieren Sie die Beads in 50 μl PBS-1 % BSA mit einer Mehrkanalpipette.
9. Biotinylierter Anti-Human-IgG-Sekundärnachweis-Antikörper gegen den Menschen wird auf 16 μg/ml in PBS-1 % BSA verdünnt.
10. Geben Sie 50 μl verdünnten Sekundärantikörper in jede Vertiefung und mischen Sie den Inhalt mit einer Mehrkanalpipette.
11. Decken Sie die Filterplatte ab und lassen Sie sie im Dunkeln bei Raumtemperatur 30 min auf einem Plattenschüttler inkubieren. Überstand durch Vakuum entfernen. Die Vertiefungen werden mit 100 μl Waschpuffer gewaschen und der Überstand durch Vakuum entfernt. Waschen 1x wiederholen.
12. Resuspendieren Sie die Beads in 50 μl PBS-1 % BSA mit einer Mehrkanalpipette.
13. Verdünnen Sie den Streptavidin-R-Phycoerythrin-Reporter (SAPE) auf 24 μg/ml in PBS-1 % BSA.
14. Geben Sie 50 μl Reporter in jede Vertiefung und mischen Sie mit einer Mehrkanalpipette.
15. Decken Sie die Filterplatte ab und lassen Sie sie im Dunkeln bei Raumtemperatur 30 min auf einem Plattenschüttler inkubieren. Überstand durch Vakuum entfernen. Die Vertiefungen werden mit 100 μl Waschpuffer gewaschen und der Überstand durch Vakuum entfernt. Waschen 1x wiederholen.
16. Resuspendieren Sie Kügelchen in 100 μl PBS-1 % BSA und analysieren Sie 50 μl mit dem Analysator.
    Anmerkung: Die Ergebnisse des Multiplex-Immunoassays werden in Einheiten der Medianen Fluoreszenzintensität (MFI) gemessen. Beziehen Sie sich immer auf die neueste Version des Software-Handbuchs, falls vorhanden, um Fehler zu vermeiden.

Tabelle 1: Arbeitsperlenmischung für den Multiplex-Immunoassay.Nachdem die Kopplung und Bestätigung abgeschlossen waren, wurde ein Mastermix bestehend aus jedem Perlensatz wie abgebildet hergestellt. Der Mastermix wurde auf alle Vertiefungen in der 96-Well-Platte verteilt. Alle Vertiefungen wurden mit Speichel inkubiert, mit Ausnahme einer Hintergrundkontrollvertiefung, die nur Kügelchen und PBS-1 % BSA-Puffer enthielt.

kg

Antigen	Perlen-Set	Kupplung Puffer	Ag-Konzentration (μg)	# Perlen in 1 Ecke	# Kügelchen/μl	Vol. für 100 B/uL für 4 ml (μl)
C. jejuni	8	MES 5.0	Nr. 50	64	6.400	94
H. pylori	33	MES 5.0	25	71	7.100	85
Hepatitis A	42	MES 5.0	100	91	9.100	66
T. gondii	30	MES 5.0	25	85	8.500	71
Norovirus GII.4	55	MES 5.0	5	72	7.200	Nr. 83
Norovirus GI.1	67	MES 5.0	5	63	6.300	95
entkoppelt	80	MES 5.0		60	6.000	100
		Gesamtvolumen der Kügelchen (μl)				594
		Gesamtvolumen des benötigten Puffers (μl)				3.406

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ausrüstung und Software
Mikrozentrifuge	Thermo Electron Corporation	75002446	Wird zum Zentrifugieren von Proben verwendet
Vortex-Mischer	VWR	G560	Wird zum Mischen von Proben verwendet
Ultraschallgerät (Mini)	Fisher Scientific	Tel.: 15-337-22	Wird verwendet, um Perlen zu trennen
Pipettierer P10, P20, P100, P1000, 8 Kanäle.	Cap	verschieden
Multiscreen-Vakuumverteiler	Millipore	MSVMHTS00	Wird in Waschschritten verwendet, um Überstände zu entfernen
Mikroschüttler	VWR	Tel.: 12620-926	Wird verwendet, um Kügelchen während der Inkubation zu rühren
Röhrchengestell (1,5 mL und 0,5 mL) (sortiert)	VWR	Tel.: 30128-346
Waage	Mettler oder andere		Wird verwendet, um Waschreagenzien für die Herstellung von Puffern zu
Dynabead Probenmischer	Invitrogen	947-01	Wird während des Kopplungs-Inkubationsschritts verwendet
MatLab (R2014b)	Die MathWorks, Inc.		Wird verwendet, um Daten zur Antikörperreaktion zu
Microsoft Excel 2014	Microsoft Corporation		Wird verwendet, um Daten zur Antikörperreaktion zu
Luminex Analyzer mit xPonent 3.1 Software	Luminex GmbH	LX200-XPON3.1	Instrument und Software für die Durchführung des Assays
antigene
GI.1 Norwalk-Virus : p-Teilchen	Xi Jiang (CCHMC)*	Na	*Kinderkrankenhaus von Cincinnati. Endkonzentration 5 μg.
GII.4 Norovirus VA387 : p-Teilchen	Xi Jiang (CCHMC)*	Na	*Kinderkrankenhaus von Cincinnati. Endkonzentration 5 μg.
Hepatitis-A-Virus : Konzentrat der Stufe II aus Zellkultur	Meridian Lebenswissenschaften	Nr. 8505	Antigen gekoppelt bei 100 μg
Helicobacter pylori : Lysat	Meridian Lebenswissenschaften	Nr. R14101	Antigen gekoppelt bei 25 μg
Toxoplasma gondii : rekombinante p30 (SAG1)	Meridian Lebenswissenschaften	Nr. R18426	Antigen gekoppelt bei 25 μg
Campylobacter jejuni : Hitze tötete ganze Zellen	KPL	Tel.: 50-92-93	Antigen gekoppelt bei 50 μg
Primäre Antikörper
Meerschweinchen-Anti-Norovirus	(CCHMC)*	Na	Wird zur Bestätigung der Kopplung verwendet
Maus Anti-Hepatitis A IgG	Meridian Lebenswissenschaften	C65885M	Wird zur Bestätigung der Kopplung verwendet
Maus Anti-Hepatitis A IgG	Meridian Lebenswissenschaften	C65885M	Wird zur Bestätigung der Kopplung verwendet
BacTraceAffinity Aufgereinigter Antikörper gegen Helicobacter pylori	KPL	01-93-94	Wird zur Bestätigung der Kopplung verwendet
Ziegen-pAb zu Toxoplasma gondii	Abcam (Englisch	Artikel-Nr.: AB23507	Wird zur Bestätigung der Kopplung verwendet
BacTrace Goat Anti-Campylobacter-Spezies	KPL	Tel.: 01-92-93	Wird zur Bestätigung der Kopplung verwendet
Sekundäre Antikörper
Biotin-SP-konjugiertes AffiniPure Donkey Anti-Ziegen IgG (H+L)	Jackson	Tel.: 705-065-149	Wird zur Bestätigung der Kopplung verwendet
Biotinyliertes Kaninchen Anti-Ziegen-IgG (H+L)	KPL	16-13-06	Wird zur Bestätigung der Kopplung verwendet
Biotinyliertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)	KPL	16-18-06	Wird zur Bestätigung der Kopplung verwendet
Affinitätsgereinigter Antikörper Biotin markierte Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)	KPL	Nr. 176-1506	Wird zur Bestätigung der Kopplung verwendet
Affinitätsgereinigter Antikörper Biotin markierte Ziege Anti-Human-IgG(γ)	KPL	16-10-02	Wird für Speichel-Immunoassays verwendet
verbrauchsartikel
1,5 mL Copolymer-Mikrozentrifugenröhrchen	USA Wissenschaftlich	Tel.: 1415-2500	Wird als Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Bindung verwendet
10 μl Nachfüllungen für Pipettenspitzen	BioVentures (Englisch)	5030050C
200 μl Nachfüllungen für Pipettenspitzen	BioVentures (Englisch)	Artikel-Nr.: 5030080C
1000 μl Nachfüllungen für Pipettenspitzen	BioVentures (Englisch)	Artikel-Nr.: 5130140C
Alufolie	Verschiedene Anbieter		Wird verwendet, um Perlen während der Inkubation im Dunkeln zu halten
Deep Well Platten	VWR	Artikel-Nr.: 40002-009	Wird zum Verdünnen von Speichelproben verwendet
Multiscreen-Filterplatten	Millipore	MABVN1250	Wird zum Ausführen von Assays verwendet
Oracol Speichelsammelsystem	Malvern Medical Developments Limited		Wird zum Sammeln von Speichel verwendet
reagenzien
Carboxylierte Mikrosphären (Kügelchen)	Luminex GmbH	Abhängig vom Wulstsatz	Antigene sind an die Mikrosphären gekoppelt
EDC (1-Ethyl-3-[3dimethylaminopropyl]carbodiimidhydrochlorid)	durchbohren	77149 oder 22980	Wird bei der Raupenaktivierung verwendet
Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid)	durchbohren	Artikel-Nr.: 24510	Wird bei der Raupenaktivierung verwendet
Steptavidin-R-Phycoerythrin (1mg/ml)	Molekulare Sonden	Nr. S-866	Einsatz als Reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure)	Sigma	Nr. M-2933	Wird zum Ankoppeln verwendet
Tween-20 (Polyoxyethylenorbitan-Monolaurat)	Sigma	P-9416	Wird in Waschpuffer verwendet, um unspezifische Bindungen zu entfernen
Protein-Puffer
PBS-TBN Blockierungs-/Lagerpuffer (PBS, 0,1 % BSA, 0,02 % Tween-20, 0,05 % Azid, pH 7,4)**			Filter: Sterilisieren und bei 4°C lagern
PBS, pH 7,4	Sigma	Nr. P-3813	138 mM NaCl, 2,7 mM KCl
Bsa	Sigma	Nr. A-7888	0,1 % (w/v)
Tween-20	Sigma	P-9416	0,2 % (v/v)
Natriumazid (0,05 % Azid)**	Sigma	Nr. S-8032	**Achtung: Natriumazid ist akut giftig. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen. Tragen Sie geeignete PSA. Entsorgen Sie gemäß den geltenden Gesetzen.
MES/ Kupplungspuffer (0,05 M MES, pH 5,0)
MES (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure)	Sigma	Nr. S-3139
5 N NaOH	Fischer	SS256-500
Assay-Puffer (PBS, 1 % BSA, pH 7,4)			Filter: Sterilisieren und bei 4°C lagern
PBS, 1 % BSA, pH 7,4	Sigma	Nr. P-3688	138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 % BSA
Aktivierungspuffer (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)			Filter: Sterilisieren und bei 4°C lagern
NaH2PO4 (Natriumphosphat, monobasisch wasserfrei)	Sigma	Nr. S-3139	0,1 Mio. NaH2PO4
5 N NaOH	Fischer	SS256-500
Waschpuffer (PBS, 0,05 % Tween-20, pH 7,4)			Filter: Sterilisieren und bei 4°C lagern
PBS, 0,05 % Tween-20, pH 7,4	Sigma	Nr. P-3563	138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05 % TWEEN