Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Phagozytose-Assay
- Inkubieren Sie 2 x 106 Leukozyten und 4 x 106 FITC-markierte Konidien (Multiplizität der Infektion = 2) in 1,5 ml RPMI + 10 % FCS in einer 12-Well-Zellkulturplatte. Schließen Sie als Kontrollen nur Zellen (keine Konidien) und Zellen + unmarkierte Konidien ein.
- In einen befeuchteten CO2 -Inkubator bei 37 °C stellen und für den gewünschten Zeitraum (z. B. 0,5 h, 2 h oder 4 h) inkubieren.
- Nach der Inkubation die Zellen mit einem Zellschaber ernten und in ein 15-ml-Röhrchen geben.
- 5 min bei 300 x g bei Raumtemperatur schleudern.
- Überstand für die Zytokinanalyse sammeln oder verwerfen, wenn nicht gewünscht. Resuspendieren Sie jede Probe in 100 μl PBS + 2 mM EDTA.
>2. Färbung von Antikörpern
- Bereiten Sie für jede Probe 100 μl Antikörpermischung vor, einschließlich APC-Anti-FITC-Antikörper, gemäß Tabelle 1.
- Geben Sie eine 100-μl-Probe in eine Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte. Fügen Sie 150 μl PBS + 2 mM EDTA zum Waschen hinzu.
- Zur Farbkompensation setzen Sie 1 x 106 Zellen für jede Farbe in weitere Vertiefungen der 96-Well-V-Bodenplatte. Fügen Sie eine Vertiefung mit Zellen hinzu, die ungefärbt bleibt. Fügen Sie 150 μl PBS + 2 mM EDTA zum Waschen hinzu.
- Decken Sie die Platte mit einer Klebefolie ab.
- 5 min bei 300 x g bei Raumtemperatur schleudern. Entfernen Sie die Folie.
- Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte nur einmal schnell und gewaltsam über die Spüle oder mit einem Einweg-Papiertuch umdrehen.
HINWEIS: Wiederholen oder klopfen Sie die Platte nicht auf ein Papier, bis sie trocken ist, da dies zu einem massiven Zellverlust von der Platte führt.
- Resuspendieren Sie die Zellen in der 100-μl-Antikörpermischung und mischen Sie sie durch Pipettieren gut.
- Für die Farbkompensation resuspendieren Sie die jeweiligen Zellen in 100 μl PBS + 2 mM EDTA und geben Sie in jede Vertiefung einen einzelnen Antikörper in der gleichen Menge, die in der Antikörpermischung verwendet wird.
- Mit einer Klebefolie abdecken und 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
- Entfernen Sie die Folie. Geben Sie zum Waschen 150 μl PBS + 2 mM EDTA in jede Vertiefung. Mit einer Klebefolie abdecken.
- 5 min bei 300 x g bei Raumtemperatur schleudern. Entfernen Sie die Folie. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell und gewaltsam über das Waschbecken oder ein Einweg-Papiertuch umdrehen.
- Resuspendieren Sie in 200 μl PBS + 2 mM EDTA und übertragen Sie die Zellen aus jeder Vertiefung in ein separates Röhrchen mit rundem Boden. Stellen Sie sicher, dass sich keine Zellcluster in der Suspension befinden. Entfernen Sie Cluster auf andere Weise.
HINWEIS: Jeder Cluster, der groß genug ist, damit das Auge ihn sehen kann, ist groß genug, um das Zytometer möglicherweise zu verstopfen.
>3. Durchflusszytometrie
- Starten Sie das Durchflusszytometer und lassen Sie es aufwärmen. Starten Sie die Erfassungssoftware.
- Erstellen Sie ein neues Experiment, und richten Sie die Stichproben ein und beschriften Sie sie.
- Einrichten von Parametern (FSC 250, SSC 250) und Detektoren für die Fluorophore FITC, APC, BUV395, V500 und PerCP-Cy5.5.
- Einrichtung der Vergütung
- Öffnen Sie die Kompensationseinrichtung.
- Geben Sie einzelne Farben an.
- Stellen Sie die PMT-Detektorspannungen mit den ungefärbten Kontrollzellen oder mit einzelnen Färbungen so ein, dass alle Ereignisse innerhalb der Skala enthalten sind.
- Zeichnen Sie mindestens 10.000 Ereignisse jedes Steuerelements auf.
- Verwenden Sie das Kompensations-Setup, um den Spillover von Fluorophoren zu berechnen und auf die Zytometereinstellungen des Experiments anzuwenden.
- Aufzeichnen von Beispieldaten
- Zeigen Sie FSC und SSC in der Erfassungssoftware an und setzen Sie ein Gate um die Leukozyten.
- Basierend auf dem Leukozyten-Gate wird das Punktdiagramm SSC/CD45 und das Gate für CD45+-Zellen zur Trennung von Konidien angezeigt.
- CD45+-Zellen in einem Punktdiagramm darstellen: CD14/CD66b und Gate-Monozyten (CD14+) und Neutrophile (CD66b+) getrennt.
- Zeigen Sie Neutrophile in einem Punktdiagramm anti-FITC/FITC an.
- Unter Verwendung der Probe mit unmarkierten Konidien werden Quadranten für Anti-FITC- und FITC-Signale festgelegt, wobei maximal 1 % der Zellen in den jeweiligen Quadranten zugelassen wird.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.5.4 und 3.5.5 für das Monozytengatter.
- Erfassen Sie alle Proben mit mindestens 20.000 Ereignissen im Leukozyten-Gate.
Tabelle 1: Antikörpermischung für die Durchflusszytometrie. Die Mengen jedes Reagenzes werden als Mikroliter pro zu analysierender Probe (1 x 10,6 Zellen) angegeben.
kg
kg
kg
| Reagenz | μl pro Probe |
| CD45 BUV395 | 1 |
| CD14 V500 | 0,5 |
| CD66b PerCP-Cy5.5 | 1,5 |
| Anti-FITC-APC | 0,5 |
| PBS + 2 mM EDTA | 97 |
| gesamt | 100 |
