Ein Immunfluoreszenz-Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung von Stressgranula bei Säugetieren

Zusammenfassung

Quelle: Aulas, A. et al., Methoden zur Klassifizierung zytoplasmatischer Herde als Stressgranula von Säugetieren.J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt einen Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung von Stressgranula bei Säugetieren, die aus mRNAs, RNA-bindenden Proteinen (RBPs) und verschiedenen anderen Proteinen bestehen.

Protokoll

>1. Zellvorbereitung

1. Geben Sie autoklavierte Deckgläser in 12 Vertiefungen einer 24-Well-Platte, wie in Abbildung 1A gezeigt. Dies kann mit einer sterilen Pasteur-Pipette erfolgen, die an einem Vakuum befestigt ist, um jedes Deckglas aufzunehmen. Klopfen Sie vorsichtig auf das Deckglas an der Seite des Bettglases, um den Sog zu lösen, sodass das Deckglas in das Bohrloch fallen kann.
2. Platte: 1 x 10⁵ U-2 OS (U2OS) Osteosarkomzellen pro Vertiefung mit einem Endvolumen von 500 μl Medium. Bewegen Sie die Platte mehrmals von einer Seite zur anderen und auf und ab, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind.
3. Drücken Sie die Deckgläser vorsichtig mit einer sauberen P1000-Spitze nach unten, um sicherzustellen, dass das Deckglas auf dem Boden der Vertiefung liegt und sich keine Blasen unter dem Deckglas befinden.

>2. Zellen belasten

1. Überprüfen Sie am nächsten Tag die Platte visuell, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt und gleichmäßig über das Deckglas zusammenfließen, da sich Abweichungen zwischen den Proben negativ auf die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse auswirken können. Verwenden Sie ein 10-fach-Objektiv an einem inversen Gewebekulturmikroskop.
2. Heizen Sie das Medium auf 37 °C vor. Vermeiden Sie es, kalte oder heiße Medien auf die Zellen aufzutragen, da diese einen Kälteschock bzw. Hitzeschock verursachen.
3. Verdünnen Sie Arzneimittel in vorgewärmten Medien. Bereiten Sie für jede unterschiedliche Arzneimittelkonzentration 2 Vertiefungen mit 500 μl Medium vor. Bereiten Sie weitere 500 μl vor, um Verluste beim Pipettieren zu berücksichtigen. Aliquot 4 Röhrchen mit je 1,5 ml.
   1. Für Natriumarsenit: In jede Vertiefung mit 500 μl Mulde sind 1,5 μl 100 mM Natriumarsenit (Endkonzentration: 100 μM) oder 0,75 μl 100 mM Natriumarsenit (Endkonzentration: 50 μM) zu geben.
   2. Für Vinorelbin: In jede Vertiefung mit 500 μl sind 22,5 μl 10 mM Vinorelbin (Endkonzentration: 150 μM) oder 18,75 μl 10 mM Vinorelbin (Endkonzentration: 100 μM) zu geben.
      Anmerkung: Natriumarsenit ist ein gut charakterisierter und häufig verwendeter Stressgranula-Induktor und wird daher klassischerweise als Positivkontrolle verwendet.
4. Entfernen und entsorgen Sie die Medien aus den Vertiefungen B1 - 4 und C1 - 4. Fügen Sie das Medium mit den Medikamenten hinzu und warten Sie 60 Minuten (Abbildung 1A).
   1. 500 μl Medium mit 100 μM Natriumarsenit in die Vertiefungen B1 und B2 geben. 500 μl Medium mit 50 μM Natriumarsenit in die Vertiefungen B3 und B4 geben.
   2. 500 μl Medium mit 150 μM Vinorelbin in die Vertiefungen C1 und C2 geben. 500 μl Medium mit 125 μM Vinorelbin in die Vertiefungen C3 und C4 geben.
5. 30 Minuten vor der Fixierung die Vertiefungen in Spalte 2 mit 5 μl Cycloheximid (1 mg/ml-Stamm) und die Vertiefungen in Spalte 4 mit 2 μl Puromycin (1,25 mg/ml-Stamm) behandeln. Schütteln Sie die Platte zum Mischen vorsichtig, bevor Sie sie wieder in den 37 °C heißen Inkubator stellen.

>3. Zellfixierung und Immunfluoreszenz

HINWEIS: Stellen Sie vor dem Experiment sicher, dass das Methanol auf -20 °C abgekühlt ist. Stellen Sie Puffer her, einschließlich phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 5% normalem Pferdeserum (NHS) in PBS und 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS.

1. Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Vertiefungen mit Deckgläsern mit PBS. Abhängig von den verwendeten Medikamenten kann es wichtig sein, die medienhaltigen Medikamente ordnungsgemäß zu entsorgen. Wenden Sie sich an das örtliche Umweltsicherheitsbüro, um spezifische Anweisungen zu erhalten. Um effizient zu waschen, füllen Sie eine Quetschflasche mit PBS, schneiden Sie die Spitze zurück, um einen sanften Fluss anstelle eines engen Strahls zu ermöglichen, und verwenden Sie dies, um PBS in jede Vertiefung zu geben, nachdem Sie das ursprüngliche PBS angesaugt haben.
2. Fixieren Sie die Zellen mit ~250 μl 4% PFA für 15 min bei Raumtemperatur, RT unter leichtem Rühren. Decken Sie die Oberseite des Deckglases vollständig mit PFA ab. 250 μl sollten ausreichend sein, aber wenn nicht, fügen Sie mehr hinzu. Vermeiden Sie es immer, direkt auf die Deckgläser zu pipettieren, da einige Zellen (oder Stressbehandlungen von Zellen) die Bindung verändern können und die Kraft des Pipettierens die Zellen lösen kann.
3. Entfernen Sie die PFA und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß. Wenden Sie sich an das örtliche Umweltamt, um Einzelheiten zur ordnungsgemäßen Entsorgung von Paraformaldehyd zu erfahren.
4. ~250 μl Methanol (-20 °C) zugeben und 5 min bei RT unter leichtem Schaukeln inkubieren; dies permeabilisiert und glättet die Zellen.
5. Entfernen und verwerfen Sie das Methanol und blockieren Sie die Zellen, indem Sie ~250 μl 5 % NHS für 1 h bei RT über Nacht, O/N, bei 4 °C auftragen. Wenden Sie sich an das örtliche Umweltsicherheitsbüro, um Einzelheiten zur ordnungsgemäßen Entsorgung von Methanol zu erfahren.
6. Bei Primärantikörpern verdünnen Sie die Antikörper in 5 % NHS.
   Anmerkung: Die Verwendung mehrerer SG-Marker ist der Schlüssel zur Bestätigung, ob es sich bei den beobachteten Granulaten um echte SGs handelt. Die Anzahl der SG-Marker, die verwendet werden können, hängt von den im Mikroskop verfügbaren Filtern ab. Wenn Standardfiltersets für Grün, Rot und Hellrot verfügbar sind, verwenden Sie G3BP1, eIF4G und eIF3b mit einer Verdünnung von 1/250.
   1. Für dieses Experiment (12 Deckgläser mit je 250 μl – insgesamt: 3 ml 5 % NHS) fügen Sie 12 μl von jedem der folgenden Stoffe hinzu: Anti-G3BP1, Anti-eIF3b und Anti-eIF4G. Die Primärantikörper werden unter leichtem Rühren mindestens 1 h bei RT oder O/N bei 4 °C inkubiert.
7. Waschen Sie die Vertiefungen 3x mit PBS und inkubieren Sie jede Wäsche 5 Minuten lang.
8. Bei Sekundärantikörpern verdünnen Sie alle Sekundärantikörper (1/250 Verdünnung) und den Hoechst-Farbstoff (1/1.000 Verdünnung) in 5 % NHS.
   1. Für dieses Experiment (12 Deckgläser à 250 μl – insgesamt: 3 ml 5 % NHS) fügen Sie 12 μl von jedem der folgenden Stoffe hinzu: Cy2-Maus, Cy3-Kaninchen und Cy5-Ziege (jeweils eine Verdünnung von 1/250) und fügen Sie 3 μl Hoechst-Farbstoff hinzu.
   2. Inkubieren Sie die Deckgläser mit den Sekundärantikörpern für 1 h bei RT. Schützen Sie die Proben während dieses und der folgenden Schritte vor Licht, indem Sie die Platte mit einer Schachtel abdecken oder eine Folie über die Oberseite der Gewebekulturschale legen.
9. Waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten.
10. Montieren Sie die Deckgläser mit einem Montagemedium auf beschriftete Objektträger. Erhitzen Sie das Einbettmedium in einem 37 °C heißen Heizblock für 10 Minuten; Dies verringert die Viskosität und erleichtert das Pipettieren. Pipettieren Sie mit einer abgeschnittenen P200-Spitze 25 μl Eindeckmedium pro Deckglas auf einen Objektträger. Auf einen Objektträger passen 4-8 Deckgläser, vorausgesetzt, der Mikroskoptisch lässt dies zu. Übertragen Sie das Deckglas mit einer feinen Pinzette von der Vertiefung auf den Objektträger und achten Sie darauf, dass Sie die Zellseite nach unten auf das Eindeckmedium legen. Drücken Sie das Deckglas mit einer sauberen P200-Spitze nach unten.
11. Sobald alle Deckgläser montiert sind, verwenden Sie gefaltetes Laborgewebe, um das überschüssige Eindeckmedium zu entfernen, indem Sie das Laborgewebe sehr fest auf den Objektträger drücken. Verwenden Sie eine Quetschflasche mit H₂O, um das überschüssige Einbettmedium abzuspülen, und wiederholen Sie dann das Abtupfen mit gefaltetem Laborgewebe, um das Wasser zu entfernen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Experimentelle Diagramme. (A) Keimzellen auf Deckgläsern, die zuvor in eine 24-Well-Platte gelegt wurden, wie angegeben. Die Reihen A und B sind 60 Minuten lang mit SA oder VRB in der angegebenen Konzentration in μM zu behandeln. Nach 60 min geben Sie CHX (Endkonzentration: 20 μg/mL für Spalte 2) oder puro (20 μg/mL Puromycin für Spalte 4) in das arzneimittelhaltige M...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
U-2 Betriebssystem	ATCC	ATCC®HTB-96™	- häufig geschrieben als "U2OS" - Kultur bei 37 °C unter 5 % CO2 in 10 % FBS/DMEM
Dulbeccos Modifikation von Eagle's Medium	Corning	10-013-CV	- abgekürzt DMEM - Enthält 4,5 g/L Glukose, Pyruvat und Phenol Red - ergänzt mit 10% FBS, 10 mM HEPES und Penicillin/Steptomycin - Vorwärmen der vorherigen Verdünnung des Arzneimittels - Vorwärmen der vorherigen Verdünnung des Medikaments
Fötales Rinderserum	Sigma	F2442-500ml	- abgekürzt FBS - zur Ergänzung von Medien
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 15630-080	- zur Ergänzung von Medien
Penicillin Streptomycin	Sigma	Nr. 0781-100ml	- zur Ergänzung von Medien
24-Well-Platte	Costar	3524
Labor-Gewebe	KIMTECH WISSENSCHAFT	Artikel-Nr.: 34120	- allgemein als "Kimwipes" bezeichnet
Deckglas für Wachstums-Deckgläser	Fisher Scientific	Tel.: 12-545-82	- vor Gebrauch autoklaviert - in der Gewebekulturhaube steril bleiben
Natrium(meta)arsenit ≥90%	Sigma	Nr. S7400-100G	- allgemein Natriumarsenit genannt und abgekürzt SA - Auflösung in Wasser bei einer Konzentration von 1 M, dann als Arbeitsmaterial auf 100 μM verdünnen
Vinorelbin	TSZ CHEM	RS055	- abgekürzt VRB - in Wasser auf 10 mM auflösen
Puromycin	Sigma	Nr. P9620	- Wird zur Beurteilung des Translationsniveaus (Ribopuromycylierung) verwendet - wird verwendet, um die Verbindung von SG mit aktiver Übersetzung zu bewerten - In Wasser auf 10 mg/ml verdünnen
Emetindihydrochlorid-Hydrat	Sigma	Nr. E2375	- Wird in Kombination mit Puro zur Beurteilung der allgemeinen Übersetzungsstufe verwendet - wird verwendet, um die Verbindung von SG mit aktiver Übersetzung zu bewerten - In Wasser auf 10 mg/ml verdünnen
Cycloheximid	Sigma	Nr. C4859	- abgekürzt CHX - wird verwendet, um die Verbindung von SG mit aktiver Übersetzung zu bewerten - In Wasser auf 10 mg/ml verdünnen
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Lonza / VWR	Artikel-Nr.: 95042-486	- abgekürzt PBS - Waschpuffer für Immunfluoreszenz
Paraformaldehyd-Reagenzqualität, kristallin	Sigma	Nr. P6148-500G	- Machen Sie eine 4%ige Lösung in heißem PBS im Abzug und rühren Sie, bis sie sich aufgelöst hat - Aliquote können mehrere Monate bei - 20 °C gelagert werden - Gefährlich, verwenden Sie Ventilation - im Sonderabfall entsorgen
Methanol, ACS	BDH / VWR	BDH1135-4LP	- vor Gebrauch auf -20°C vorgekühlt - im Sonderabfall entsorgen
Normales Pferdeserum	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 31874	- abgekürzt NHS - Verdünnung auf 5% in PBS - Natriumazid für die Lagerung bei 4°C - Blockierungslösung für Immunfluoreszenz
Ethanol, rein, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC	Decon Labs / VWR	Artikel-Nr.: 89125-188	- Mit Wasser auf 70% verdünnen
Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger	Fisherbrand	Artikel-Nr.: 12-550-15
Maus-Anti-G3BP1-Antikörper (TT-Y)	Santa Cruz	SC-81940	- lagern bei 4 °C - Verwendung in einer Verdünnung von 1/100
Kaninchen-Anti-eIF4G-Antikörper (H-300)	Santa Cruz	SC-11373	- lagern bei 4 °C - 1/250 Verdünnung
Ziege anti eIF3η (N-20) Antikörper	Santa Cruz	SC-16377	- eIF3η ist auch bekannt als eIF3b - lagern bei 4 °C - 1/250 Verdünnung
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Maus IgG (H+L)	Jackson Immunforschung	Tel.: 715-225-150	- in Wasser nach Herstellerangaben rekonstituieren, dann bei 4°C lagern - 1/250 Verdünnung
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Kaninchen IgG (H+L)	Jackson Immunforschung	Tel.: 711-165-152	- in Wasser nach Herstellerangaben rekonstituieren, dann bei 4°C lagern - 1/2500 Verdünnung
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Ziegen IgG (H+L)	Jackson Immunforschung	Tel.: 705-175-147	- in Wasser nach Herstellerangaben rekonstituieren, dann bei 4°C lagern - 1/250 Verdünnung
Hoechst 33258 Lösung	Sigma	Artikel-Nr.: 94403-1ML	- Inkubieren mit Sekundärantikörper-Stammlösung 0,5 mg/ml in dH20, vor Licht schützen- Bei 4 °C lagern
20 x SSC-Puffer	Thermo Fischer Ambion	AM9763	- mit RNase freiem Wasser (DEPC-behandelt) auf 2X SSC verdünnen - bei Raumtemperatur lagern - Waschpuffer für FISH
Montagemedien für Schienen	Hausgemacht	/	- 5 g "kaltlöslichen" Poly(vinylalkohol) in 20 ml PBS mischen - durch Beschallung mischen, anschließend über Nacht bei RT- 5 ml Glycerin und 0,2 ml 20 % Natriumazid zugeben und 16 h bei RT- Zentrifugation bei 20.000 g für 20 min rühren, große pelletaliquot viskose Flüssigkeit verwerfen, Langzeitlagerung bei -20°C, 1 Woche bei 4°C
Parafilm "M"	Sigma	Nr. P7793-1EA	- wird in der Regel als "Parafilm" bezeichnet
Poly(vinylalkohol)	Sigma	P-8136-250G	- Reagenz zur Herstellung von Vinol
Glycerin	Sigma	Nr. G5516-100ML	- Reagenz zur Herstellung von Vinol
Natriumazid	Fisher Scientific	Nr. S2002-5G	- Konservierungsmittel zum Blockieren von Lösung und Vinol - eine 20%ige Verdünnung in Wasser vornehmen

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