Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Vorbereitung des Assays
- Sammeln, vorbereiten und organisieren Sie die für das Verfahren spezifizierten Materialien (siehe Tabelle der spezifischen Materialien/Geräte).
- Etikettieren Sie 12 x 75 mm Rohre.
- Für jeden Teilnehmer sind zwei Röhrchen zu beschriften: ein Röhrchen für den Phagozytose-Assay (dieses Röhrchen mit schwarzer Tinte und einem "F" für Fluorescein-Isothiocyanat [FITC]) und ein Röhrchen für den Oxidative Burst (OB)-Aktivitätsassay (dieses Röhrchen mit roter Tinte und einem "H" für Dihydroethidium [HE] beschriften).
Anmerkung: Die Verwendung von sterilen 12 x 75 mm Röhrchen wird empfohlen, um eine unbeabsichtigte zelluläre Aktivierung und die damit verbundene Erhöhung des Hintergrundrauschens zu minimieren.
- Markieren Sie drei Röhrchen für die Assay-Kontrollen: ein Röhrchen für den Phagozytose-Assay (FITC-Kontrolle: Markieren Sie dieses Röhrchen mit schwarzer Tinte und einem "F"), ein Röhrchen für den OB-Aktivitätsassay (HE-Kontrolle: Markieren Sie dieses Röhrchen mit roter Tinte und einem "H") und ein Röhrchen für die Negativkontrolle (Nur Blut: Markieren Sie dieses Röhrchen mit grüner Tinte und "nur Blut").
- Bereiten Sie Stammlösungen mindestens einen Tag vor dem Tag des Assays vor.
- Bereiten Sie die sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor. 100 ml 10x PBS mit 900 ml 18,2 MΩ H2O verdünnen. Filter mit einem 0,2 μm Filter sterilisieren. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie die sterile PBS-Glukose vor. Löse 1,0 g Glukose in 100 ml PBS auf. Filter mit einem 0,2 μm Filter sterilisieren. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie den sterilen 0,1 M Citratpuffer vor. 1,2 g Zitronensäure und 1,1 g Natriumcitrat werden in 100 ml 18,2 MΩ H2O gelöst. Der pH-Wert wird auf 4,0 eingestellt. Filter mit einem 0,2 μm Filter sterilisieren. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie die HE-Stammlösung vor. 1,0 mg HE in 1,0 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) resuspendieren. Vorsichtig mischen, aliquotieren und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie die FITC-markierte Stammlösung für Staphylococcus aureus (S. aureus) (2 x 109 Partikel/ml) vor. Resuspendieren Sie 10 mg FITC-markierten S. aureus in 1,5 ml (oder einer angemessenen Menge) PBS. In drei 500 μl Aliquote aufteilen und gemäß Herstellerempfehlung beschallen. Aliquotieren und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie die unmarkierte S. aureus-Stammlösung (2 x 109 Partikel/ml) vor. Resuspendieren Sie 100 mg unmarkierten S. aureus in 15 ml (oder einer angemessenen Menge) PBS. In dreißig 500 μl Aliquote aufteilen und gemäß der Empfehlung des Herstellers beschallen. Aliquotieren und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie am Tag des Assays frische Arbeitslösungen vor.
- Bereiten Sie die HE-Arbeitslösung vor. 10 μl aufgetaute HE-Stammlösung auf 990 μl PBS-Glukose umfüllen. Vor Licht schützen und bis zur Verwendung auf Eis aufbewahren.
- Bereiten Sie die FITC-markierte S. aureus-Arbeitslösung (133.333 Partikel/μl) vor. 70 μl aufgetaute, FITC-markierte S. aureus-Stammlösung auf 980 μl PBS überführen. Vor Licht schützen und bis zur Verwendung auf Eis aufbewahren.
- Bereiten Sie die unmarkierte S. aureus-Arbeitslösung (133.333 Partikel/μl) vor. 70 μl aufgetaute, unmarkierte S. aureus-Stammlösung auf 980 μl PBS übertragen. Vor Licht schützen und bis zur Verwendung auf Eis aufbewahren.
- Bereiten Sie die Quenchlösung vor. 750 μl 0,4%ige Trypanblaulösung werden zu 11,25 ml sterilem 0,1 M Citratpuffer gegeben. Bis zur Verwendung in einem Eiswasserbad aufbewahren.
- Lassen Sie einen zertifizierten Phlebotomisten gemäß den Richtlinien der Weltgesundheitsorganisation für die Blutentnahme Blut abnehmen.
- Entnehmen Sie Blut in ein 4-ml-Blutentnahmeröhrchen, das Dikaliumethylendiamintetraessigsäure (K2EDTA) enthält. Drehen Sie das Blutentnahmeröhrchen gemäß den Anweisungen des Herstellers um. Bewahren Sie das Blutentnahmeröhrchen bis zur Verwendung bei Raumtemperatur auf einer Tischwippe auf. Verwenden Sie dieses Blut für das vollständige Blutbild (CBC) mit der Differentialanalyse der weißen Blutkörperchen (WBC), die in Schritt 1.2.1 beschrieben ist.
- Entnehmen Sie Blut in ein 4-ml-Blutentnahmeröhrchen, das Lithium-Heparin enthält. Drehen Sie das Blutentnahmeröhrchen gemäß den Anweisungen des Herstellers um. Bewahren Sie das Blutentnahmeröhrchen bis zur Verwendung bei Raumtemperatur (RT) auf einer Tischwippe auf. Verwenden Sie dieses Blut für den in Schritt 2 beschriebenen Monozyten- und Granulozyten-Phagozytose- und OB-Aktivitätsassay.
- Bestimmen Sie die Menge an Bakterien (z. B. S. aureus), die benötigt wird, um den Assay für jede Probe abzuschließen.
- Verwenden Sie ein Hämatologie-Analysegerät, um eine CBC-Differentialanalyse mit Leukozyten-Differentialanalyse am Blut durchzuführen, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben. Notieren Sie sich die Leukozytenzahl (in Zellen/ml), die %Neutrophilen- und die %Monozytenwerte.
- Verwenden Sie die folgenden Gleichungen, um die Neutrophilen- und Monozytenzahl für jede Probe zu bestimmen.
Neutrophilenzahl (in Zellen/ml) = %Neutrophile × Leukozyten (in Zellen/ml)
Monozytenzahl (in Zellen/ml) = %Monozyten × Leukozyten (in Zellen/ml)
- Verwenden Sie die folgenden Gleichungen, um die Phagozytenzahl für jede Probe und die Anzahl der in 100 μl der Probe vorhandenen Phagozyten zu bestimmen.
Phagozytenzahl (in Zellen/ml) = Neutrophilenzahl (in Zellen/ml) + Monozytenzahl (in Zellen/ml)
Anzahl der Fresszellen in 100 μl = (Phagozytenzahl (in Zellen/ml))/10
- Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Anzahl der Bakterien (d. h. S. aureus) zu bestimmen, die für jede Probe benötigt werden, und die Menge an FITC-markiertem S. aureus oder unmarkierter S. aureus-Arbeitslösung (133.333 Partikel/ml), die jedem Röhrchen zugesetzt werden sollte.
Anmerkung: Das Zielbakterien-Fresszellen-Verhältnis beträgt 8:1,
Anzahl der benötigten Bakterien = Anzahl der Fresszellen in 100 μl × 8
Volumen des benötigten FITC oder der unmarkierten Arbeitslösung (in μl) = (Anzahl der benötigten Bakterien)/(133.333 Partikel/μl)
>2. Assay durchführen
- Bereiten Sie Vollblut für den Assay vor.
- Für jeden Teilnehmer und jedes Kontrollröhrchen wird mit einer verlängerten Pipettenspitze 100 μl Vollblut aus dem Lithium-Heparin-Blutentnahmeröhrchen auf den Boden eines entsprechend beschrifteten 12 x 75 mm großen Röhrchens übertragen. Kappen ersetzen.
Anmerkung: Achten Sie darauf, dass kein Blut an den Seiten der 12 x 75 mm Schläuche gelangt.
- Mit einer Mikropipette 10 μl HE-Arbeitslösung in die mit roter Tinte und einem "H" gekennzeichneten Röhrchen, einschließlich des HE-Kontrollröhrchens, geben. Kappen und Wirbel kurz wieder aufsetzen.
- Inkubieren Sie alle Röhrchen in einem 37 °C heißen Wasserbad für 15 min. Dann sofort alle Schläuche für 12 min in ein Eiswasserbad geben.
Anmerkung: Verwenden Sie ein offenes Metallgestell und schütteln Sie das Gestell alle 5 Minuten vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Röhrchen schnell und ausreichend erwärmt oder gekühlt werden.
- Fügen Sie der Probe und den Kontrollröhrchen Bakterien (z. B. S. aureus) hinzu.
- Mit einer Mikropipette die entsprechende Menge (berechnet in Schritt 1.2.4) unmarkierter S. aureus-Arbeitslösung in die mit roter Tinte und einem "H" markierten Röhrchen, einschließlich des HE-Kontrollröhrchens, geben. Kappen und Wirbel kurz wieder aufsetzen.
- Die entsprechende Menge (berechnet in Schritt 1.2.4) der FITC-markierten S. aureus-Arbeitslösung wird mit einer Mikropipette in die mit schwarzer Tinte und einem "F" gekennzeichneten Röhrchen, einschließlich des FITC-Kontrollröhrchens, gegeben. Kappen und Wirbel kurz wieder aufsetzen.
- Vertexen Sie das Kontrollröhrchen "nur Blut", aber fügen Sie keine der beiden Bakterienarten (z. B. S. aureus) hinzu.
- Inkubieren Sie alle Röhrchen 20 Minuten lang in einem 37 °C heißen Wasserbad. Verwenden Sie ein offenes Metallgestell und schütteln Sie das Gestell alle 5 Minuten vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Röhrchen schnell und ausreichend erwärmt werden. Nach der Inkubationszeit alle Röhrchen sofort für 1 Minute in ein Eiswasserbad geben.
- Waschen Sie die Zellen.
- Verwenden Sie eine Repetierpipette, um 100 μl eiskalte Quenchlösung in alle Röhrchen zu geben. Setzen Sie die Verschlüsse wieder auf, wirbeln Sie sie kurz vor und inkubieren Sie dann alle Röhrchen 1 Minute lang auf Eis.
- Verwenden Sie eine Repeater-Pipette, um 1 ml eiskaltes PBS in alle Röhrchen zu geben. Kurz vortexen, dann zusätzlich 2 ml eiskaltes PBS in alle Röhrchen geben und die Verschlüsse wieder aufsetzen. Alle Röhrchen werden 5 Minuten lang bei 4 °C und 270 x g zentrifugiert und dann der Überstand abgesaugt.
- Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 einmal (insgesamt 2 Wäschen).
- Bereiten Sie Proben für die Durchflusszytometrie vor.
- Verwenden Sie eine Repetierpipette, um 50 μl eiskaltes fötales Rinderserum in alle Röhrchen zu geben. Alle Röhren kurz durchwirbeln.
- Übertragen Sie alle Röhrchen in ein geeignetes Karussell und verwenden Sie eine automatisierte Zelllysevorbereitungsarbeitsstation mit Erythrozytenlyse (RBC) und Leukozytenfixierungsreagenzien, um die Erythrozyten zu lysieren und die Leukozyten zu fixieren, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben.
