Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Versuchsaufbau
- Verwenden Sie Folien aus Filterpapier (Platten aus faserigem hydroxyliertem Polyester, siehe Materialtabelle).
- Schneiden Sie Streifen in der Größe 3 x 15 mm für ein 1 Monat altes Kind und in L-Form für ältere Kinder und Erwachsene aus (5 x 20 x 10 mm (kurzer Arm des L)).
- Führen Sie mit einer Pinzette ein Stück Filterpapier in jedes Nasenloch eines Säuglings ein. Legen Sie das Filterpapier auf den vorderen Teil der unteren Nasenmuschel (ca. 1 cm innerhalb des Nasenlochs für Neugeborene und 1,5 cm für alle anderen Altersgruppen).
- Lege Neugeborene auf ein Bett und gib ihnen Zuckerwasser, damit sie sich wohlfühlen.
Anmerkung: Bei Kindern jeden Alters ist die Probenahme am einfachsten, wenn der Proband auf einem Stuhl sitzt.
- Bei älteren Kindern führen Sie den langen Arm des L-förmigen Filterpapiers in jedes Nasenloch ein.
- Bringen Sie einen Nasenclip um die Nasenlöcher an, um Beschwerden zu minimieren und einen versehentlichen Verlust des Filterpapiers zu vermeiden.
- Entfernen Sie die Filterpapiere nach 2 Minuten Absorption.
- Legen Sie die Filterpapiere in beschriftete Röhrchen und frieren Sie sie sofort bei -80 °C ein.
- Notieren Sie sich alle Symptome einer Atemwegsinfektion, die das Kind am Tag der Probenahme zeigt.
- Notieren Sie jegliches Niesen, anhaltendes Weinen oder Nasenbluten, das während der 2-minütigen Probenahme auftritt.
>2. Quantifizierung von Immunmediatoren der Atemwege
- Entnehmen Sie bis zu 10 Stichproben aus dem Gefrierschrank. Notieren Sie sich die Identifikationsnummern. Bewahren Sie die Proben während des gesamten Arbeitsprozesses auf Eis auf.
- Tauchen Sie nach dem Auftauen auf Eis die Filterpapiere (pro Subjekt) aus beiden Nasenlöchern in 300 μl frisch zubereiteten Puffer (siehe Materialtabelle), der eine vollständige Proteasehemmer-Tablette (siehe Materialtabelle) pro 25 ml Puffer enthält.
- Passen Sie das Volumen des Puffers an die Größe des Filterpapiers an.
- Verwenden Sie 300 μl Puffer für Filterpapiere mit einer Größe von 3 x 15 mm.
- Wenn nur ein Filterpapier verfügbar ist, verwenden Sie die Hälfte des Puffervolumens (150 μL).
- Übertragen Sie die Proben für 5 Minuten auf einen Plattenschüttler (400 U/min). Verwenden Sie einen Timer.
- Übertragen Sie die feuchten Filterpapiere und den Assay-Puffer in den Becher eines Celluloseacetat-Röhrchenfilters (0,22 μm Porengröße), der sich in einem Mikrozentrifugenröhrchen befindet (siehe Materialtabelle).
- Zentrifugieren Sie bei 16.000 x g für 5 min in einer gekühlten Zentrifuge (bei 4 °C), um filtrierten Nasenextrakt im Röhrchen zu erhalten.
- Nehmen Sie den Becher heraus und halten Sie die Röhrchen auf Eis, während Sie den Nasenextrakt in die Vertiefungen der proteinarmen Aufbewahrungsplatten aliquotieren (siehe Materialtabelle).
- Bis zur Analyse bei -80 °C lagern.
- Bestimmen Sie die Konzentrationen von Zytokinen und Chemokinen in den Nasenextrakten mit einem hochempfindlichen, auf Elektrochemilumineszenz basierenden Multiplex-Array-System (siehe Materialtabelle).
c: Hier wurden ein humaner 10-Plex-TH1/TH2-Zytokin-Assay, ein 9-Plex-Chemokin-Assay und Single-Plex-Interleukin-17A (IL-17A), der transformierende Wachstumsfaktor-beta1 (TGF-β1) und das thymusische stromale Lymphopoietin (TSLP) durchgeführt.
- Für die Assays werden die Nasenextrakte über Nacht bei 4 °C inkubiert. Führen Sie die Messungen gemäß dem Standardprotokoll des Herstellers durch (siehe Materialtabelle).
Anmerkung: Die Immunoassays (siehe Materialtabelle) haben in der Regel einen hohen dynamischen Messbereich zwischen 1 und 10.000 pg/ml, bei einigen Assays kann er jedoch auch 100.000 pg/ml betragen. Das bedeutet, dass alle Proben in der gleichen Verdünnung durchgeführt werden können, wodurch der Einfluss unterschiedlicher Verdünnungen bei gesunden und kranken Probanden begrenzt wird, wie es bei anderen ähnlichen Immunoassays der Fall ist. Die untere Nachweisgrenze für alle Zytokine lag bei 1 pg/ml oder weniger, und für Chemokine lag sie zwischen 1 und 50 pg/ml. TSLP war bei 98 % der Proben im Alter von 1 Monat nicht nachweisbar.
