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>1. Entwerfen und Vorbereiten der Peptide
- Erwerben Sie die Sequenz des interessierenden Fusionsproteins aus einer öffentlichen Datenbank wie NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) oder der Viruspathogendatenbank (https://www.viprbrc.org). Wählen Sie die Proteaseerkennungsstelle vor dem Fusionspeptid und schließen Sie 2-3 Aminosäuren stromaufwärts und stromabwärts dieser Sequenz ein.
- Bei der Bestellung der Peptide modifizieren Sie diese mit dem FRET-Paar 7-Methoxycumarin-4-ylacetyl (MCA) am N-Terminus und N-2,4-dinitrophenyl (DNP) am C-Terminus.
Anmerkung: Mehrere Anbieter bieten diese Modifikationen an. Preis und Lieferzeit hängen vom Lieferanten der Wahl ab. Es gibt jedoch alternative Modifikationen, die in der Empfindlichkeit variieren und Anpassungen des Plattenlesers in Bezug auf die Wellenlängen erfordern.
- Resuspendieren Sie das Peptid gemäß den Empfehlungen des Herstellers, indem Sie es vorsichtig auf und ab pipettieren. Resuspendieren Sie beispielsweise Peptide in 70 % Ethanol bis zur Endkonzentration von 1 mM.
- Optional wird das Röhrchen, das das Peptid und das Lösungsmittel enthält, in ein Ultraschallbad gegeben, bis es vollständig resuspendiert ist, wenn das Peptid durch Pipettieren nicht sehr gut resuspendiert wird.
- Aliquotieren Sie das Peptid in lichtdämpfende oder widerstandsfähige Röhrchen, um das Peptid vor dem Ausbleichen zu schützen. Halten Sie die Aliquot-Größen klein, um mehrere Gefrier-/Auftauzyklen zu vermeiden (z. B. 100 μl). Aliquots bei -20° C lagern.
>2. Vorbereiten des Fluoreszenzplatten-Readers
- Schalten Sie den Tellerleser ein und warten Sie, bis der Selbsttest abgeschlossen ist.
- Öffnen Sie die Betriebssoftware auf dem angeschlossenen Computer und stellen Sie sicher, dass er mit dem Plattenleser verbunden ist.
- Öffnen Sie die Temperatureinstellung und stellen Sie sie auf 30 °C ein (oder die gewünschte Temperatur für eine optimale Leistung der Protease).
- Klicken Sie auf Steuerung | Instrument Setup zum Einrichten des Experiments.
- Wählen Sie "Kinetisch" aus.
- Wählen Sie Fluoreszenz aus.
- Geben Sie Anregungs- und Emissionswellenlängen ein: 330 nm bzw. 390 nm.
- Deaktivieren Sie die Option Automatische Abschaltung.
- Wählen Sie Mittele, normale Empfindlichkeit.
- Wählen Sie eine Laufzeit von 1 h für den Assay und wählen Sie alle 60 s eine Messung aus.
- Stellen Sie 5 s Mischen vor der ersten Messung und 3 Sekunden vor jeder Messung ein
- Wählen Sie die Wells aus, um den Assay zu lesen und zu starten.
>3. Vorbereitung des Assays
- Bereiten Sie den Assay-Puffer vor, indem Sie die entsprechenden Mengen für jeden Inhaltsstoff berechnen und hinzufügen. Für Furin stellen Sie einen Puffer her, der aus 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM 2-Mercaptoethanol und 5 % Triton X-100 besteht. Für Trypsin ist eine phosphatgepufferte Standardkochsalzlösung (PBS) zu verwenden.
Anmerkung: Volumina von 10 ml oder weniger sind ausreichend. Abhängig von der Protease(n), die im Assay verwendet wird, variiert der Puffer .
- Den Puffer auf Eis kalt stellen.
- Legen Sie die Assay-Platte auf Eis mit einer dünnen Metallplatte darunter, um die Kühlung und Stabilität zu unterstützen. Verwenden Sie eine massive schwarze 96-Well-Platte aus Polystyrol mit flachem Boden und unbehandelt.
Anmerkung: Es ist wichtig, schwarze Platten zu verwenden, um fluoreszierende "Leckagen" aus benachbarten Bohrlöchern zu verhindern.
- Berechnen Sie die geeignete Menge an Protease, die für jede Reaktion hinzugefügt werden soll, basierend auf früheren Veröffentlichungen oder experimentellen Daten. Für Furin ist 1 Einheit pro Reaktion zu verwenden, was 0,5 μl entspricht. Verwenden Sie für Trypsin 0,5 μl 160 nM TPCK-Trypsin.
- Pro Probe werden 3 technische Replikate pro Assay mit einem Gesamtvolumen von 100 μl pro Probe vorbereitet.
Anmerkung: Es wurde experimentell evaluiert, dass es keinen Unterschied macht, ob das Pipettieren unter normalen Lichtverhältnissen oder bei gedimmtem Licht durchgeführt wird. Die Peptide sollten jedoch nicht über einen längeren Zeitraum dem Licht ausgesetzt werden.
- Pipettieren Sie die entsprechende Menge des Assay-Puffers (94,5 μl, wie in Schritt 3.1 beschrieben) in jede Vertiefung.
- Gib die Protease in jede Vertiefung. Sowohl für Furin als auch für TPCK-Trypsin ist eine Dosis von 0,5 μl pro Probe zu verwenden. In 6 Vertiefungen (3 Vertiefungen für eine Blindkontrolle und 3 Vertiefungen für eine Peptidkontrolle) wird 0,5 μl Puffer anstelle der jeweiligen Protease zugegeben.
- Fügen Sie das Peptid bis zu einer Endkonzentration von 50 μM in jeder Vertiefung mit Ausnahme der Blindkontrolle hinzu. In diesem Fall wurde die Pipette 5 μL Peptid hergestellt, wie in Schritt 1.3 beschrieben. Geben Sie 5 μl Puffer anstelle von Peptid in die Blindkontrolle.
Anmerkung: Mehrere Konzentrationen des Peptids wurden zunächst mit den beschriebenen Enzymkonzentrationen getestet, um sicherzustellen, dass die Enzyme gesättigt waren.
- Setzen Sie die Platte in den Fluoreszenzplatten-Reader ein und klicken Sie auf Start.