Ein fluorogener Peptidspaltungsassay zum Screening der proteolytischen Aktivität von Proteasen

Abstract

Quelle: Jaimes, J. A., et al. Ein fluorogener Peptidspaltungsassay zum Screening auf proteolytische Aktivität: Anwendungen für die Aktivierung des Coronavirus-Spike-Proteins. J. Vis. (2019).

Dieses Video zeigt einen Assay zum Screening der proteolytischen Aktivität von Proteasen mit fluorogenen Peptiden. Die Protease erkennt ihre Spaltstelle auf dem Peptid, spaltet es und trennt den Quencher vom Fluorophor, wodurch seine Fluoreszenzemission ermöglicht wird. Das Fluoreszenzsignal wird detektiert und analysiert, um die Spaltungseffizienz verschiedener Peptidvarianten zu überprüfen.

Protocol

>1. Entwerfen und Vorbereiten der Peptide

1. Erwerben Sie die Sequenz des interessierenden Fusionsproteins aus einer öffentlichen Datenbank wie NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) oder der Viruspathogendatenbank (https://www.viprbrc.org). Wählen Sie die Proteaseerkennungsstelle vor dem Fusionspeptid und schließen Sie 2-3 Aminosäuren stromaufwärts und stromabwärts dieser Sequenz ein.
2. Bei der Bestellung der Peptide modifizieren Sie diese mit dem FRET-Paar 7-Methoxycumarin-4-ylacetyl (MCA) am N-Terminus und N-2,4-dinitrophenyl (DNP) am C-Terminus.
   Anmerkung: Mehrere Anbieter bieten diese Modifikationen an. Preis....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
peptide	Biomatik	N/A
Furin	Schnabel	P8077S
Trypsin, TPCK-behandelt	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 4352157-1KT
HEPES	Sigma-Aldrich	Nr. H3375
CaCl2	Sigma-Aldrich	Nr. C1016
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
Triton-X100	Sigma-Aldrich	X100
Pbs	Corning	21-040-CV
SpectraMax Gemini XPS	Molekulare Bauelemente	XPS (Englisch)
SoftMax Pro 6.5.1	Molekulare Bauelemente	N/A
96-Well-Platte (massives schwarzes Polystyrol mit flachem Boden und unbehandelt)	Costar	3915
Leichte Dämpfungsrohre	Watson Lab	131-915BL oder 131-915BR