Überwachung der Ankunft von GFP-markierten Oberflächenproteinen im trans-Golgi-Netzwerk mit funktionalisierten Nanobodies

Zusammenfassung

Quelle: Buser, D. P., et al. Analyse der endozytären Aufnahme und des retrograden Transports zum trans-Golgi-Netzwerk unter Verwendung funktionalisierter Nanobodies in kultivierten Zellen. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt eine Methode zur Untersuchung der Aufnahme und des retrograden Transports von funktionalisierten Nanobodies, um ihre intrazellulären Transportwege zu verstehen. Durch die Einführung von radioaktiv markiertem Sulfat und den Einsatz von Isolierungs- und Nachweistechniken ermöglicht diese Methode die Untersuchung der endozytären Aufnahme und der Ankunft von Frachtproteinen im trans-Golgi-Netzwerk.

Protokoll

>1. Aufnahme funktionalisierter Nanobodies durch kultivierte Zellen (für die Sulfatierungsanalyse)

1. In einer Zellkulturhaube säen ~400.000 bis 500.000 HeLa-Zellen, die ein GFP-markiertes Reporterprotein stabil exprimieren, in 35-mm-Schalen oder auf 6-Well-Clustern mit vollständigem Medium, das Antibiotika enthält (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), 100 Einheiten/ml Streptomycin, 2 mM l-Glutamin und 1,5 μg/ml Puromycin).
   Anmerkung: Wie oben erwähnt, verwenden wir hier zur Veranschaulichung HeLa-Zellen, die EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR und TfR-EGFP stabil exprimieren. Neben stabilen Zelllinien kann auch transient transfiziertes HeLa verwendet werden.
2. Inkubieren Sie die Zellen O/N bei 37 °C in einem 7,5 % CO₂ -Inkubator, um sie zu vermehren.
   Anmerkung: Die Zellen sollten am nächsten Tag eine Konfluenz von ~80% aufweisen.
3. Das komplette Medium entfernen, 2 Mal mit 1x PBS bei RT waschen und die Zellen 1 h bei 37 °C in einem 7,5%igen CO₂ -Inkubator mit sulfatfreiem Medium (SFM) aushungern.
   Anmerkung: SFM wird durch Zugabe von 10 ml MEM-Aminosäuren (50x)-Lösung, 5 ml L-Glutamin (200 mM), 5 ml Vitaminlösung (100x) und 900 μl CaCl_{2,2H 2}O zu 500 ml ausgewogenen Eagle-Salzen hergestellt. Durch einen 0,22 μm Filter passieren und aliquotieren.
4. In einer belüfteten Haube oder einem Labor, die für Radioaktivitätsarbeiten vorgesehen sind, ist ein Sulfatmarkierungsmedium herzustellen, das 0,5 mCi/ml [³⁵S] Sulfat als Natriumsalz in SFM.
   Vorsicht: Gehen Sie vorsichtig mit allen Lösungen um, die Radioaktivität enthalten. Arbeiten Sie nur in dafür vorgesehenen Hauben oder Bänken. Sämtliches Material (Spitzen, Rohre, Platten usw.) oder Waschpuffer, die mit Radioaktivität in Berührung kommen, müssen getrennt gesammelt und entsorgt werden. Tun Sie dies auch für alle folgenden Schritte (Schritte 1.5-1.18).
5. VHH-2xTS in 1x PBS in das Sulfatmarkierungsmedium bis zu einer Endkonzentration von 2 μg/ml geben.
   Anmerkung: Als Kontrolle ist auch VHH-std oder ein anderer Nanobody ohne TS-Stellen einzubeziehen, um eine spezifische Markierung zu demonstrieren.
6. Ersetzen Sie SFM durch 0,7 mL Sulfatmarkierungsmedium mit 0,5 mCi/ml [35S]Sulfat und 2 μg/mL VHH-2xTS und inkubieren Sie die Zellen 1 h lang bei 37 °C in einem 7,5 %_{CO 2} -Inkubator, der für die Arbeit mit Radioaktivität vorgesehen ist.
   Anmerkung: Abhängig vom geplanten Experiment muss die Zeit der Nanobody-Sulfatierung angepasst werden. Darüber hinaus wird zur Bestimmung der TGN-Ankunftskinetik eine Markierung für verschiedene Zeiten durchgeführt (z. B. für 10 Minuten, 20 Minuten, 30 Minuten usw.).
7. Entfernen Sie das Markierungsmedium und waschen Sie die Zellen 2-3 Mal mit eiskaltem 1x PBS auf einer Kühlplatte oder Eis.
8. Geben Sie 1 ml Lysepuffer (PBS enthält 1 % Triton X-100 und 0,5 % Desoxycholat), ergänzt mit 2 mM PMSF und 1x Proteasehemmer-Cocktail und inkubieren Sie die Zellen 10-15 Minuten lang auf einer schaukelnden Plattform bei 4 °C.
9. Kratzen Sie das Lysat ab und überführen Sie es in ein 1,5-ml-Röhrchen, wirbeln Sie das Lysat und legen Sie es 10-15 Minuten lang auf einen durchgehenden Rotator bei 4 °C.
10. Ein postnukleäres Lysat wird durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C hergestellt.
11. Bereiten Sie mit einem neuen 1,5-ml-Röhrchen 20-30 μl einer Aufschlämmung aus Nickelkügelchen in einem 1,5-ml-Röhrchen vor und waschen Sie sie einmal mit 1x PBS, indem Sie sie vorsichtig bei 1.000 x g für 1 min.
    Anmerkung: Anstelle von Nickelkügelchen können Streptavidinkügelchen (wenn der Nanobody biotinyliert ist) oder Protein-A-Kügelchen mit einem IgG gegen ein Epitop des Nanobodies (T7- oder HA-Tag) verwendet werden.
12. Das postnukleäre Lysat wird in ein 1,5-ml-Röhrchen mit Nickelkügelchen überführt und 1 h bei 4 °C auf einem End-over-End-Rotator inkubiert, um die Nanobodies zu isolieren. Entnehmen Sie ein Aliquot (50-100 μl) des postnukleären Lysats und kochen Sie es in SDS-Probenpuffer für die anschließende Immunoblot-Analyse des gesamten zellassoziierten Nanobodies, des GFP-Reporters und der Beladungskontrolle.
13. Waschen Sie die Kügelchen 3 Mal mit 1x PBS oder Lysepuffer, indem Sie sie bei 1.000 x g für 1 min.
    vorsichtig pelletieren. Anmerkung: Für eine strengere Reinigung der Kügelchen kann 20 mM Imidazol in PBS oder Lysepuffer aufgenommen werden.
14. Entfernen Sie vorsichtig alle Waschpuffer von den Kügelchen, fügen Sie 50 μl 2x Probenpuffer hinzu und kochen Sie sie 5 Minuten lang bei 95 °C.
15. Laden Sie beide gekochten Kügelchen auf ein Midi-Gel mit 12,5 % SDS-PAGE und lassen Sie es gemäß dem Standard-PAGE-Protokoll laufen, bis der Referenzfarbstoff (z. B. Bromphenolblau) das Ende des Trenngels erreicht hat.
    Anmerkung: Die Immunoblot-Analyse des gesamten zellassoziierten Nanobodies, des GFP-Reporters und der Loading-Kontrolle kann auch mit einem Mini-12,5%-SDS-PAGE oder einem vorgefertigten Gradientengel durchgeführt werden.
16. Fixieren Sie das Trenngel in ~30 mL Fixierpuffer (10% Essigsäure und 45% Methanol in ddH₂O) für 1 h bei RT, waschen Sie das Gel dreimal mit ~50 mL deionisiertem Wasser und bereiten Sie die Geltrocknung vor.
17. Trocknen von SDS-PAGE Gelen.​
    1. Legen Sie das fixierte Gel vorsichtig auf eine gespannte Frischhaltefolie und decken Sie diese mit vorgestanztem Filterpapier ab.
    2. Legen Sie das Gel mit dem Filterpapier nach unten auf die Trocknungsplattform, setzen Sie die Vakuumabdeckung auf und schalten Sie die Vakuumpumpe für die Geltrocknung ein. Trocknen Sie das Gel für 3-5 Stunden.
    3. Entfernen Sie die Frischhaltefolie und geben Sie das getrocknete Gel in eine Autoradiographie-Kassette, die mit einem Phosphor-Sieb ausgestattet ist.
18. Bild-Autoradiogramm mit einem Phosphor Screen Imager. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
    Anmerkung: Je nach Stärke des Signals müssen getrocknete Gele länger mit Phosphor-Sieben belichtet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-GFP-Antikörper	Sigma-Aldrich	1.18145E+11	Das Produkt wird von SigmaAldrich vertrieben, aber von Roche hergestellt
Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich
Fötales Kälberserum (FCS)	Biowest (Biowesten)
Schwefel-35 als Natriumsulfat	Hartmann Analytik	ARS0105	Produkt enthält 5 mCi
6-Well-Platten	Wärmekraftwerk	Artikel-Nr.: 92406
Paraformaldehyd (PFA)	Applichem	Nr. A3813
Fluormount-G	Südliche Biotechnologie	Tel.: 0100-01
Mini-Protean TGX Gele, 4-20%, 15- gut	Bio-Rad	Tel.: 456-1096