Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Parasiten-Kultur
HINWEIS: Befolgen Sie die örtlichen Vorschriften für den Umgang mit menschlichen Krankheitserregern.
- Bewahren Sie Plasmodium falciparum-Parasiten gemäß dem Standardprotokoll auf, wie zuvor im Parasitenkulturmedium beschrieben (siehe Materialtabelle).
- Halten Sie die Parasiten mit einer Sorbitbehandlung wie zuvor beschrieben eng synchronisiert.
- Um eine VAR2CSA Expression auf der Oberfläche der mit Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten (IE) zu gewährleisten, führen Sie wiederholte Runden der immunmagnetischen Selektion mit einem Anti-VAR2CSA-Antikörper (z. B. PAM1.4-Antikörper, einem kreuzreaktiven humanen monoklonalen VAR2CSA-spezifischen IgG) durch, der an Protein-G-Magnetkügelchen gekoppelt ist.
- Kurz gesagt, inkubieren Sie Trophozoite-IEs im späten Stadium mit magnetischen Kügelchen, die an einen Anti-VAR2CSA-Antikörper gekoppelt sind, und selektieren Sie mit einem Magneten positiv.
- Expandieren Sie die ausgewählten Parasiten in Kultur für einige Zyklen, bis die Parasitämie mindestens 5% beträgt.
- Alternativ können Sie Parasiten auswählen, die an plastikimmobilisiertes CSA (den Rezeptor für VAR2CSA) binden, wie zuvor beschrieben.
- Um VAR2CSA Expression auf den ausgewählten Parasiten zu überprüfen, führen Sie die Durchflusszytometrie wie zuvor beschrieben durch.
- Kurz gesagt, markieren Sie die Trophozoit-IEs im späten Stadium mit demselben Antikörper, der für die magnetische Selektion (Schritt 1.3) verwendet wurde, gefolgt von einem fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper.
- Messen Sie die IE-Oberflächenreaktivität durch Durchflusszytometrie. Eine erfolgreiche Antikörperselektion führt in der Regel zu einer Parasitenpopulation, die bei den meisten Parasiten VAR2CSA exprimiert (≈80%).
- Für den Phagozytose-Assay verwenden Sie gereinigte Trophozoit-IEs im mittleren bis späten Stadium. Führen Sie die Reinigung durch magnetische Trennung durch, wie zuvor beschrieben.
Anmerkung: Um das Stadium der Parasiten genau zu bestimmen, führen Sie eine Giemsa-Färbung auf Blutausstrichen durch, gefolgt von einer lichtmikroskopischen Beobachtung. Befolgen Sie die Standardverfahren und morphologischen Richtlinien wie zuvor beschrieben. Die Reinigung in der Spätphase kann auch mit einem Dichtegradientenmedium durchgeführt werden. Unserer Erfahrung nach ist die IE-Ausbeute jedoch geringer, so dass eine magnetische Reinigung vorzuziehen ist.
- Für die magnetische Trennung die Parasitenkultur (5-10% Parasitämie) bei 500 x g für 10 min bei Raumtemperatur schleudern. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in 10 ml Parasitenkulturmedium.
- Geben Sie die Parasitensuspension in eine Claricep Flash Silica, CS-Säule, die mit einem Magneten gekoppelt ist (siehe Materialtabelle) und lassen Sie sie langsam durch die Säule laufen. Trophozoite-IEs sind paramagnetisch (aufgrund des Vorhandenseins von Hämozoin) und verbleiben im Säulennetz.
- Waschen Sie die Säule mit 50 mL Parasitenkulturmedium und eluieren Sie die IEs von der magnetischen Säule mit 50 mL Parasitenkulturmedium.
- Das Eluat aus 1.5.3 bei 500 x g 10 min bei Raumtemperatur schleudern. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und suspendieren Sie ihn in 1 ml Parasitenkulturmedium.
- Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Anzahl der IEs (die durch Lichtmikroskopie leicht als Erythrozyten mit dunklem Hämozoinpigment identifiziert werden können) und die Gesamtzahl der Zellen, um die endgültige Parasitämie (Prozentsatz der IEs) zu berechnen.
Anmerkung: Verwenden Sie nur Parasiten mit einer Reinheit von mindestens 80 % (80 % IEs).
- Schätzen Sie auf der Grundlage der Anzahl der für den Test geplanten Serum-/Antikörperproben die Gesamtmenge der benötigten IEs und skalieren Sie die Parasitenkulturen entsprechend hoch. Ein 75-cm-2-Kulturkolben mit 25 ml Kultur bei 5 % Hämatokrit und 5-10 % Parasitämie sollte genügend IEs liefern, um eine volle 96-Well-Platte zu betreiben. Für eine vollständige Platte (42 Proben plus 6 Kontrollen in doppelter Ausfertigung) wird mindestens 1,5 ml Parasitensuspension bei 3,3 x 107 IEs/ml benötigt.
>2. THP-1-Zellen
HINWEIS: In diesem Assay wird die THP-1-Zelllinie verwendet. Diese Monozytenzelllinie stammt von einem Patienten mit monozytärer Leukämie und kann über die American Type Culture Collection (ATCC) erworben werden. Pflegen Sie die Zelllinie gemäß den Anweisungen des Anbieters im THP-1-Kulturmedium (siehe Materialtabelle).
- Für eine regelmäßige Wartung beginnen Sie die THP-1-Zellkultur bei 2-4 x 105 Zellen/ml und die Subkultur, wenn die Zellkonzentration 8 x 105 Zellen/ml erreicht.
Anmerkung: Lassen Sie die Zellkonzentration 1 x 106 Zellen/ml nicht überschreiten und behalten Sie die Passagenummer im Auge. Vermeiden Sie die Verwendung von Zellen, die sich außerhalb der Passage 25 befinden. Die durchschnittliche Verdopplungszeit der THP-1-Zelllinie variiert zwischen 19-50 h. Bestimmen Sie die Verdopplungszeit der Zellcharge, bevor Sie mit den Phagozytose-Experimenten beginnen. Dies wird dazu beitragen, die erforderliche Kulturmenge grob abzuschätzen, die für eine bestimmte Anzahl von zu testenden Serumproben erforderlich ist (z. B. werden für eine volle 96-Well-Platte 10 ml Kultur bei 5 x 105 Zellen/ml benötigt).
- Überprüfen Sie die THP-1-Zellen regelmäßig auf die Oberflächenexpression der Fcγ-Rezeptoren I (CD64), II (CD32) und III (CD16), wie zuvor beschrieben.
- Kurz gesagt, färben Sie die THP-1-Zellen (separat) mit fluoreszenzmarkierten Anti-CD64-, Anti-CD32- und Anti-CD16-Antikörpern (Materialtabelle) für 30 Minuten bei Raumtemperatur (1:100 Verdünnung, hergestellt in 2% fötalem Rinderserum (FBS) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Dreimal mit 2 % FBS in PBS waschen und Oberflächenfärbung mittels Durchflusszytometrie messen.
Anmerkung: Die THP-1-Zellen sind negativ für CD16 und positiv für CD32 und CD64, wie zuvor berichtet (Abbildung 1).
- Für den Phagozytose-Assay wird am Tag vor dem Experiment ein THP-1-Zellkulturkolben mit 2,5 x 105 Zellen/ml so aufgestellt, dass am Tag des Assays etwa 5 x 105 Zellen/ml erhalten werden.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass am Tag des Assays 4-6 x 105 Zellen/ml vorhanden sind.
>3. Phagozytose-Assay (Abbildung 2)
- Vor Beginn des Assays zwei 96-Well-Platten mit rundem Boden (eine für die Opsonisierung und eine für die Phagozytose) mit 150 μl pro Well sterilem 2 % FBS in PBS blockieren (>1 h).
Anmerkung: Bezeichnen Sie die Platte 1 als Opsonisationsplatte und verwenden Sie sie sowohl für die Färbung von Ethidiumbromid (EtBr) als auch für die Opsonisation. Markieren Sie die Platte 2 als Phagozytoseplatte und verwenden Sie sie sowohl für die THP-1-Zellplattierung als auch für den Phagozytoseschritt.
- Parasitenfärbung und Opsonisierung
- Nehmen Sie die in Nummer 1,6 hergestellte IE-Suspension und passen Sie die Zellzahl auf 3,3 x 107 IEs/ml an, indem Sie Parasitenkulturmedium und Ethidiumbromid (EtBr) hinzufügen, um eine Endkonzentration von 2,5 μg/ml (1:40 Verdünnung, aus einem Stamm von 0,1 mg/ml) zu erreichen.
Anmerkung: EtBr färbt die DNA des Parasiten und ermöglicht so den Nachweis durch Durchflusszytometrie.
Vorsicht: EtBr ist ein Mutagen und reizt die Haut, die Augen und die Atemwege. Verwenden Sie einen angemessenen Schutz und entsorgen Sie Abfälle gemäß den örtlichen Vorschriften.
- Entfernen Sie die Blockierungslösung von einer der 96-Well-Platten (Opsonisationsplatte), schnippen Sie die Platte und entfernen Sie den Flüssigkeitsüberschuss über ein Stück Handtuchpapier.
- Geben Sie 30 μl der oben vorbereiteten IE-Suspension pro Vertiefung in die obere Hälfte der Platte. Lassen Sie eine Vertiefung leer und fügen Sie 30 μl Parasitenkulturmedium hinzu (ohne IEs für die THP-1-Kontrolle allein). (Abbildung 3A). 10 min bei Raumtemperatur und lichtgeschützt inkubieren.
- Fügen Sie 170 μl Parasitenkulturmedium pro Vertiefung hinzu. Den Teller bei 500 x g 3 min bei Raumtemperatur drehen und den Überstand entfernen, indem man den Teller über einen geeigneten Abfallbehälter schnippt.
- Waschen Sie die EtBr-markierten IEs zwei weitere Male mit 200 μl pro Vertiefung Parasitenkulturmedium und drehen Sie die Platte 3 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500 x g. Der Überstand aus der ersten Wäsche kann durch Schnippen der Platte entfernt werden. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus der zweiten Wäsche mit einer Mehrkanalpipette, um sicherzustellen, dass das gesamte Volumen des Waschmediums entfernt wird. Stören Sie das Pellet nicht.
- Resuspendieren Sie die EtBr-markierten IEs in 30 μl Antikörper-/Plasma-/Serumlösung, die in den gewünschten Konzentrationen in einem Parasitenkulturmedium hergestellt wurde.
- Fügen Sie immer die folgenden Kontrollen hinzu (Abbildung 3B): eine Kontrolle ohne IEs/THP-1-Zellen (Parasitenkulturmedium); eine Kontrolle ohne Antikörper oder Plasma/Serum (nicht opsonisierte Kontrolle); eine Positivkontrolle mit dem im Handel erhältlichen Kaninchen-Anti-Human-Erythrozyten-Antikörper in einer Verdünnung von 1:100 (siehe Materialtabelle)); zwei negative Plasma-/Serumkontrollen in einer Verdünnung von 1:5 (ein Malaria-naiver Pool und ein Pool von Malaria-exponierten Männern); und eine positive Serumkontrolle in einer Verdünnung von 1:5 (ein Pool von Malaria-exponierten Frauen, die zuvor schwanger waren (vorzugsweise Multigravidae)).
Anmerkung: Eine Verdünnung von 1:100 für die Positivkontrolle scheint bei verschiedenen Chargen gekaufter Antikörper konsistent zu funktionieren (Daten nicht gezeigt). Es wird jedoch empfohlen, Abweichungen zwischen den Chargen auszuschließen, indem jedes Mal, wenn eine neue Antikörpercharge verwendet wird, mehrere Verdünnungen getestet werden.
- 45 min im Dunkeln bei 37 °C inkubieren.
- Vorbereitung der THP-1-Zellen und Phagozytose
- Während die IEs opsonisiert werden (3.2.8), beginnen Sie mit der Vorbereitung der THP-1-Zellen.
- Die THP-1-Zellen werden aus dem Kulturkolben genommen, nach unten geschleudert (500 x g für 5 min bei Raumtemperatur), den Überstand dekantiert und das Pellet wieder im THP-1-Zellkulturmedium suspendiert.
- Schleudern Sie erneut (500 x g für 5 min bei Raumtemperatur), dekantieren Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in 1 mL THP-1-Zellkulturmedium.
- Bestimmen Sie die Zellzahl in der oben vorbereiteten Lösung und fügen Sie mehr Medium hinzu, um eine Endkonzentration von 5 x 105 Zellen/ml zu erhalten.
- Entfernen Sie die Blockierungslösung von der restlichen 96-Well-Platte (Phagozytoseplatte), indem Sie die Platte schnippen und den Flüssigkeitsüberschuss über ein Stück Handtuchpapier entfernen.
- 100 μl der in 3.3.4 hergestellten THP-1-Zellsuspension pro Vertiefung zugeben und wieder in den Zellkultur-Inkubator geben (Abbildung 3C).
- Nach Ablauf der Antikörper-/Plasma-/Serum-Inkubationszeit fügen Sie 170 μl Parasitenkulturmedium pro Vertiefung hinzu. Den Teller bei 500 x g 3 min bei Raumtemperatur drehen und den Überstand entfernen, indem man den Teller über einen geeigneten Abfallbehälter schnippt.
- Waschen Sie die opsonisierten IEs zwei weitere Male mit 200 μl pro Vertiefung Parasitenkulturmedium und drehen Sie die Platte 3 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500 x g. Der Überstand aus der ersten Wäsche kann durch Schnippen der Platte entfernt werden. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus der zweiten Wäsche und stellen Sie mit einer Mehrkanalpipette sicher, dass das gesamte Volumen des Waschmediums entfernt wird. Stören Sie das Pellet nicht.
- Zum Schluss werden die opsonisierten IEs in 100 μl vorgewärmtem THP-1-Zellkulturmedium resuspendiert. Übertragen Sie 50 μl opsonisierte IE-Suspension in jede Vertiefung in der Phagozytoseplatte. Da es insgesamt 100 μl IEs gibt, kann jede Antikörper-/Serumverdünnung in Duplikaten in der Phagozytoseplatte (Abbildung 3D) durchgeführt werden
Anmerkung: Die Menge der im Assay verwendeten IEs und THP-1-Zellen entspricht einem Verhältnis von 10:1.
- 40 min im Dunkeln bei 37 °C, 5 % Kohlendioxid (CO2) inkubieren.
Anmerkung: Lassen Sie die Phagozytose nicht länger als 40 Minuten anhalten.
- Stoppen Sie die Phagozytose durch Zentrifugation bei 4 °C (500 x g, 5 min) und verwerfen Sie den Überstand durch Schnippen der Platte. 150 μl Ammoniumchlorid-Lysinglösung bei Raumtemperatur zugeben (Materialtabelle) und durch Pipettieren mischen, genau 3 Min. inkubieren< br />
Anmerkung: In diesem Schritt werden die Erythrozyten lysiert, die nicht von den THP-1-Zellen phagozytiert wurden.
- Stoppen Sie die Lyse, indem Sie 100 μl eiskaltes 2%iges FBS in PBS hinzufügen. Die Platte bei 4 °C (500 x g für 3 min) drehen und den Überstand entfernen, indem Sie die Platte über einen geeigneten Abfallbehälter schnippen.
- Waschen Sie die Platte dreimal mit 200 μl pro Mulde eiskaltem 2 % FBS in PBS und schleudern Sie die Platte bei 4 °C (500 x g für 3 Minuten). Nach der letzten Wäsche in 200 μl eiskaltem 2 % FBS in PBS resuspendieren und sofort mittels Durchflusszytometrie analysieren.
Anmerkung: In früheren Veröffentlichungen wurde die Zellfixierung in 2 % Paraformaldehyd vor der Durchflusszytometrie31 verwendet, aber die hier vorgestellten Ergebnisse wurden unmittelbar nach Abschluss des Assays gewonnen. Es wird nicht empfohlen, die Datenerfassung bei Durchflusszytometrie durch Lagerung der Platte bei 4 °C zu verschieben, da der Anteil der EtBr+ THP-1-Zellen schnell abnimmt (Abbildung 4).
>4. Erfassung und Analyse der Durchflusszytometrie
HINWEIS: Jedes Durchflusszytometer, das das 96-Well-Plattenformat unterstützt und über die entsprechenden Laser/Filter zur Messung der EtBr-Fluoreszenz verfügt, kann verwendet werden.
- Für die Erfassung gattern Sie THP-1-Zellen mit einem linearen Vorwärtsstreudiagramm (FSC) vs. linearer Seitenstreuung (SSC) unter Verwendung der Wells, in denen keine IEs hinzugefügt wurden (Abbildung 2A), und erfassen Sie 10.000 Ereignisse auf diesem Gatter.
- Messen Sie die Fluoreszenzintensität für EtBr (FL3-Log) auf dem THP-1-Gate mit Hilfe eines Histogrammdiagramms.
- Für das Gating wird das erste Gate auf THP-1-Zellen in einem FSC- vs. SSC-Dichtediagramm unter Verwendung der Wells verwendet, in denen keine IEs hinzugefügt wurden (Abbildung 5A). Richten Sie dann ein positives Gate in einem FL3 (EtBr)-Histogramm ein, wobei die THP-1-Zellen (keine IEs hinzugefügt) und die nicht opsonisierte Kontrolle (Abbildung 5B)
verwendet wurden.
- Kopieren Sie diese Gates in alle anderen Proben, die in derselben Platte getestet wurden, und bestimmen Sie den Prozentsatz der EtBr-positiven THP-1-Zellen (THP-1-Zellen, die mindestens einen IE phagozytiert haben). Für jede der getesteten Proben kann die Phagozytose als absolute Werte (Prozentsatz der EtBr+ THP-1-Zellen) oder als relative Phagozytose angegeben werden, die als Prozentsatz berechnet wird, wobei die Positivkontrolle als Maximum verwendet wird.
