HINWEIS: Die folgenden Protokolle beschreiben die Probenvorbereitung und die Quantifizierung der Aktivität von neutrophilen Serinproteasen (NSPs). Die hier vorgestellten experimentellen Verfahren konzentrieren sich auf die Messung der Aktivität von humanem Sputum und neutrophiler Elastase (NE) oder Cathepsin G (CG). Geringfügige Anpassungen im Probenvorbereitungsprotokoll ermöglichen jedoch die Analyse von Blutzellen und Tumorhomogenaten. Darüber hinaus können die Matrix-Metalloproteinase- und Cathepsin-S-Aktivitäten in ähnlicher Weise mit Hilfe spezieller FRET-Sonden untersucht werden
>1. Probenvorbereitung: Zellisolierung und Überstandstrennung
HINWEIS: Wenn möglich, sollte die Behandlung des Auswurfs innerhalb von 120 Minuten nach dem Auswurf durchgeführt werden und der Auswurf sollte bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis gelagert werden.
- Wenn ein spontaner Auswurf des Auswurfs nicht möglich ist, induzieren Sie den Auswurf wie zuvor beschrieben. Inhalieren Sie kurz 200 μg des β-2-Rezeptor-Antagonisten Salbutamol, bevor Sie mit dem Sputum-Induktionsverfahren beginnen. Inhalieren Sie anschließend 15 Minuten lang eine hypertone (6%) Kochsalzlösung mit einem Vernebler. Sammeln Sie den ausgespuckten Auswurf in einer Petrischale.
- Trennen Sie die Schleimklumpen aus dem Speichel mit Hilfe einer Pipettenspitze in eine Petrischale.
- Wiegen Sie den Schleim.
Anmerkung: Das durchschnittliche Gewicht einer Schleimprobe beträgt 0,8 g (variiert zwischen 0,1 g und 5 g); 0,1 g sind in der Regel ausreichend, um die genannten Verfahren durchzuführen.
- Fügen Sie dem Sputum 4 Teile (v/w) 10 % Sputolysin (in PBS) hinzu (z. B. 4 ml 10 % Sputolysin pro Gramm Sputum).
Vorsicht: Sputolysin besteht aus konzentriertem Dithiothreitol in Phosphatpuffer, gehen Sie daher vorsichtig damit um.
- Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur (RT) auf einem Schaukelschüttler für 15 Minuten, um den Schleim aufzulösen. Setzen Sie den Shaker aus Sicherheitsgründen in einen Abzug ein.
- Quaktieren Sie die Reaktion, indem Sie das gleiche Volumen kaltes PBS hinzufügen (z. B. 1 ml kaltes PBS pro ml 10 % Sputolysin).
- Durch Pipettieren mischen, um eine homogene Lösung zu erhalten.
- Filtrieren Sie die Mischung durch ein 100 μm Nylon-Zellsieb in ein 50-ml-Röhrchen.
- Wiederholen Sie den Filtrationsschritt durch ein 40 μm Nylon-Zellsieb.
- Die Lösung wird 10 min lang bei 300 x g bei 4 °C zentrifugiert.
- Die Überstandsfraktion vorsichtig in ein frisches Röhrchen überführen und auf Eis lagern.
Anmerkung: Die Überstandsfraktionen können bis zur weiteren Analyse bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden.
- Das Zellpellet vorsichtig in 500 μl kaltem PBS resuspendieren und auf Eis legen.
Anmerkung: Die Zellfraktion muss sofort verarbeitet werden.
>2. Messung der Serinproteaseaktivität von Neutrophilen
HINWEIS: Hier werden verschiedene Methoden vorgestellt, um die Aktivität von NSP mit Hilfe von FRET-Reportern zu quantifizieren. Die Wahl der Technologie wird durch die spezifische biomedizinische Fragestellung und den Zweck des Experiments bestimmt. Die vorgestellten Sonden wurden ausgiebig auf ihre Spezifität gegen eine Reihe lungenrelevanter Enzyme getestet. Obwohl die Sonden spezifisch für ihr Zielenzym sind, überprüfen Sie immer die Sondenspezifität an der klinischen Probe von Interesse. Dies kann erreicht werden, indem die Probe vor der Sondenzugabe mit einem spezifischen Proteaseinhibitor inkubiert wird, wodurch jede Erhöhung des Donor/Akzeptor-Verhältnisses (D/A) aufgehoben werden sollte.
- Quantifizierung der Aktivität löslicher NSPs mittels Fluorimeter oder Plate Reader Assay
Anmerkung: Die Proteaseaktivität in löslichen Fraktionen der Probe kann mit jedem Gerät nachgewiesen werden, das zur Fluoreszenzdetektion fähig ist.
- Tauen Sie Enzyme auf Eis auf.
- Bewahren Sie NE und CG bis zur Verwendung in einem sauren Lagerpuffer (50 mM Natriumacetat, 200 mM NaCl, pH 5,5) auf, um eine Selbstspaltung zu verhindern.
- Um eine Enzymstandardkurve einzurichten, bereiten Sie eine serielle Verdünnung des Enzyms im Verhältnis 1:2 (33,9 - 0,271 nM für NE; 42,6 - 0,333 nM für CG) in Aktivierungspuffer (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl bei pH 7,5) vor. Der Aktivierungspuffer hat einen neutralen pH-Wert und ermöglicht somit eine effiziente enzymatische Katalyse.
- Zur Herstellung der höchsten Standardkonzentration (NE-Konzentration: 33,9 nM) verdünnen Sie 1 μl NE (33,9 μM) in 999 μl Aktivierungspuffer
.
- Zur Herstellung des zweiten Standards (NE-Konzentration: 16,95 nM) werden 200 μl der ersten Verdünnung mit 200 μl Aktivierungspuffer gemischt.
- Gehen Sie entsprechend vor, um die restlichen 1:2 Verdünnungen vorzubereiten.
- Der letzte Standard, der Blank, besteht aus einem reinen Aktivierungspuffer. Die Messung von technischen Duplikaten oder Triplikaten wird empfohlen. Versuchen Sie während der Standard- und Probenvorbereitung, die Fläschchen auf Eis zu halten.
- Parallel zur Standardpräparation werden die Sputumproben in einem Aktivierungspuffer verdünnt. Verdünnen Sie die menschlichen Proben, bevor Sie ihre Proteaseaktivität beurteilen, um im linearen Bereich der Erhöhung des Reportersignals (D/A-Verhältnis) zu bleiben. Würde man die Patientenproben unverdünnt lassen, würde die Spaltung zu schnell erfolgen, um eine zuverlässige Anpassung zu gewährleisten. Da gesundes Spender-Sputum im Vergleich zu Proben von Patienten mit Mukoviszidose (CF) und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) weniger aktive Proteasen enthält, werden in der Regel unterschiedliche Verdünnungen durchgeführt (1:10 für gesunden Sputumüberstand, 1:20-500 für Sputum-Überstand von COPD- oder CF-Patienten).
Anmerkung: Um die Proteaseaktivität in Proben, deren Konzentration unbekannt ist, quantitativ zu messen, muss eine Standardkurve mit bekannten Enzymkonzentrationen parallel gemessen werden, idealerweise auf derselben Platte. Die Konzentration des aktiven Enzyms im menschlichen Sputum wird berechnet, indem die in menschlichen Sputumproben gemessenen Steigungen mit den mit den Standardkurven gemessenen Steigungen interpoliert werden.
- Bevor Sie die Proben für die Messung vorbereiten, richten Sie das Gerät ein. Stellen Sie die Anregungswellenlänge für die NE Förster Resonance Energy Transfer-based (FRET) Sonde (NEmo-1) auf 354 nm und die Detektionswellenlänge auf 400 nm für den Donor und 490 nm für den Akzeptor ein. Stellen Sie die Anregungswellenlänge für die CG FRET-Sonde (sSAM) auf 405 nm und die Emission auf 485 (Donor) und 580 nm (Akzeptor) ein.
- Geben Sie 40 μl Standard- oder Blindproben in die Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Halbflächenplatte.
- Zur Herstellung des Mastermixes, der die Reporter enthält (Konzentration des Reporters im Mastermix: 10 μM), wird das Sondenmaterial (1 mM in Dimethylsulfoxid, DMSO) 1:100 in Aktivierungspuffer verdünnt. Bereiten Sie das benötigte Mastermix-Volumen vor, indem Sie 10 μl mit der Anzahl der erforderlichen Plate-Wells multiplizieren. Um die optimale Endkonzentration (2 μM) für die Fluoreszenzmessung von NEmo-1- und sSAM-Reportern zu erreichen, geben Sie 10 μl des Mastermixes in jede Vertiefung (enthält 40 μl einer Probe, Standard oder Leerprobe) und starten Sie die Auslesung. NEmo-1- und sSAM-Reporter werden daher die Aktivität der löslichen neutrophilen Elastase bzw. des Cathepsin-G überwachen.
Anmerkung: Wenn kein Reagenzinjektor verfügbar ist, stellen Sie sicher, dass die Auslesung so bald wie möglich nach der Zugabe des Reporters zu den Proben gestartet wird.
- Starten Sie die Messung des Plattenlesers und zeichnen Sie die Erhöhung des D/A-Verhältnisses alle 60-90 Sekunden für mindestens 20 Minuten auf oder bis der Anstieg des Signals ein Plateau erreicht.
- Berechnen Sie nach dem Exportieren der Daten das D/A-Verhältnis, indem Sie die relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) des Donors durch die RFU des Akzeptors für jeden Zeitpunkt und jede Probe dividieren.
- Berechnen Sie den Mittelwert des D/A-Verhältnisses und die Standardabweichung jeder Probe.
- Bestimmen Sie die Steigung innerhalb des linearen Wachstums der Änderung des D/A-Verhältnisses. Die Steigung ist ein Indikator für die Enzymspaltungsrate für eine FRET-Sonde. Berechnen Sie die Konzentration des aktiven Enzyms im Sputum, indem Sie die aus den menschlichen Proben abgeleiteten linearen Regressionssteigungen mit denen abgleichen, die aus dem Enzymstandard berechnet wurden.
