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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitung des mikrofluidischen Geräts.
- Vorbereitung von mikrofluidischen Zellmigrationsassays
- Bereiten Sie 50 μg/ml Fibronektinlösung vor, indem Sie 50 μl Stammfibronektinlösung (1 mg/ml) auf 950 μl Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) in einer Biosicherheitswerkbank verdünnen.
- Bereiten Sie das Migrationsmedium vor, indem Sie 9 ml Medium des Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) und 1 ml RPMI-1640 mit 4 % Rinderserumalbumin (BSA) mischen.
- Entfernen Sie das entionisierte Wasser aus dem Gerät.
- Geben Sie 100 μl Fibronektinlösung aus der Steckdose in das Gerät. Warten Sie 3 Minuten, um sicherzustellen, dass alle Kanäle mit Fibronektinlösung gefüllt sind. Stellen Sie das mikrofluidische Gerät für 1 h bei Raumtemperatur in eine abgedeckte Petrischale.
- Entfernen Sie die Fibronektinlösung aus dem Gerät. Fügen Sie 100 μl Migrationsmedium aus der Steckdose hinzu. Warten Sie 3 Minuten, um sicherzustellen, dass alle Kanäle mit Migrationsmedium gefüllt sind.
- Inkubieren Sie das Gerät für weitere 1 h bei Raumtemperatur, dann ist das Gerät bereit für das Chemotaxis-Experiment.
- Vorbereitung der Chemolockstofflösung für das Chemotaxis-Experiment.
- Bereiten Sie 100 nM fMLP-Lösung in einem Migrationsmedium mit insgesamt 1 ml vor. Mischen Sie 5 μl FITC-Dextran (10 kDa, 1 mM) mit der fMLP-Lösung in einem 1,5 mL Röhrchen.
Anmerkung: FITC-Dextran wird zur Gradientenmessung verwendet. Alternativ können Sie Rhodamin als Gradientenindikator verwenden. Die fMLP-Chemolockstofflösung ist dann bereit für das Chemotaxis-Experiment.
- Vorbereitung der Sputumprobe.
Anmerkung: Als klinisch-diagnostische Anwendung dieser All-on-Chip-Methode wurde eine neutrophile Chemotaxis getestet, die durch einen Gradienten von Sputumproben von COPD-Patienten induziert wird.
- Beschaffung eines Humanethikprotokolls zur Entnahme von Sputumproben von COPD-Patienten.
Anmerkung: Wir haben die Genehmigung zur Probenentnahme im Seven Oaks General Hospital in Winnipeg erhalten (genehmigt von der University of Manitoba).
- Holen Sie die schriftlichen Einverständniserklärungen aller Probanden ein.
- Sammeln Sie spontane Sputumproben von COPD-Patienten. Geben Sie die 500-μl-Sputumprobe in ein 1,5-ml-Röhrchen.
- 500 μl 0,1 % Dithiothreitol in das 1,5 mL Röhrchen geben und vorsichtig mischen. Legen Sie die Tube für 15 min in ein Wasserbad bei 37 °C.
- Die Probe wird bei 753 x g für 10 min zentrifugiert und dann der Überstand entnommen. Den Überstand bei 865 x g 5 min zentrifugieren und dann den endgültigen Überstand auffangen. Bewahren Sie den gesammelten Überstand vor der Verwendung in einem -80 °C Gefrierschrank auf.
- Wenn die Sputumlösung für das Chemotaxis-Experiment bereit ist, tauen Sie sie auf, geben Sie 900 μl Migrationsmedium in ein 1,5-ml-Röhrchen und mischen Sie es mit 100 μl Sputumlösung in einer Biosicherheitswerkbank. Die Sputumlösung ist dann bereit für das Chemotaxis-Experiment.
- Entnahme von Blutproben.
- Erhalten Sie ein Ethikprotokoll für Menschen, um Blutproben von gesunden Spendern zu entnehmen. Holen Sie die schriftlichen Einverständniserklärungen aller Blutspender ein.
Anmerkung: Hier wurden Proben im Victoria General Hospital in Winnipeg entnommen (genehmigt vom Joint-Faculty Research Ethics Board der University of Manitoba).
- Entnehmen Sie die Blutprobe durch Venenpunktion und geben Sie die Probe in ein EDTA-beschichtetes Röhrchen. Bewahren Sie das Röhrchen vor dem Versuch in einer Biosicherheitswerkbank auf.
>2. All-on-Chip-Chemotaxis-Assay-Betrieb
- Isolierung der On-Chip-Zellen (Abbildung 1B).
- 10 μl Vollblut in ein 1,5 ml-Röhrchen in eine Biosicherheitswerkbank geben.
Anmerkung: Einzelheiten zur Blutentnahme sind Abschnitt 1.4 zu entnehmen.
- Geben Sie 2 μl Antikörpercocktail (Ab) und 2 μl magnetische Partikel (MP) aus dem Neutrophilen-Isolationskit (siehe Materialtabelle) in das 1,5-ml-Röhrchen und mischen Sie es vorsichtig. Dadurch werden die Zellen im Blut mit Ausnahme der Neutrophilen markiert.
- Inkubieren Sie das Blut-Ab-MP-Gemisch 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Anmerkung: Dadurch werden die Antikörper-markierten Zellen im Blut magnetisch markiert.
- Befestigen Sie zwei kleine Magnetplatten an den beiden Seiten der Zellenladeöffnung des Geräts. Saugen Sie das Medium an allen Anschlüssen des Geräts an.
- Pipettieren Sie langsam 2 μl Blut-Ab-MP-Gemisch aus der Zellladeöffnung in das mikrofluidische Gerät.
HINWEIS: Die magnetisch markierten Zellen sind an den Seitenwänden der Zellladeöffnung gefangen, während Neutrophile in das Gerät fließen und an der Andockstruktur der Zelle gefangen werden.
- Warten Sie einige Minuten, bis genügend Neutrophile im Andockbereich der Zellen gefangen sind.
>3. Chemotaxis-Assay (Abbildung 1C).
- Stellen Sie das mikrofluidische Gerät auf den temperaturgesteuerten Mikroskoptisch bei 37 °C.
- Geben Sie 100 μl Chemolockstofflösung (fMLP oder Sputumlösung) und 100 μl Migrationsmedium mit zwei Pipettieren in die dafür vorgesehenen Einlassreservoire; dies erzeugt einen Chemoattraktstoffgradienten im Gradientenkanal durch kontinuierliches laminares Mischen auf Basis von Chemikalien, das von einer Druckausgleichsstruktur unterstützt wird.
Anmerkung: Einzelheiten zur Sputumentnahme von COPD-Patienten sind in Abschnitt 1.3 enthalten.
- Für das Experiment zur Kontrolle des Mediums wird nur Migrationsmedium in beide Einlassbehälter gegeben.
- Erfassen Sie das Fluoreszenzbild von FITC-Dextran im Gradientenkanal.
- Importieren Sie das Image in die ImageJ-Software mit dem Befehl "Datei|Öffnen".
- Messen Sie das Fluoreszenzintensitätsprofil über den Gradientenkanal mit dem Befehl "Analysieren|Plot Profile".
- Exportieren Sie die Messdaten in eine Tabelle, um sie weiter zu plotten.
- Inkubieren Sie das Gerät auf dem temperierten Mikroskoptisch oder in einem herkömmlichen Zellkultur-Inkubator für 15 min.
- Stellen Sie den Gradientenkanal mit einem 10X-Objektiv dar, um die endgültigen Positionen der Zellen für die Datenanalyse aufzuzeichnen.
- Zeichnen Sie bei Bedarf die Zellmigration im Gerät durch Zeitraffermikroskopie auf.
>4. Analyse von Zellmigrationsdaten (Abbildung 1C)
- Analysieren Sie den Chemotaxis-Assay, indem Sie den Zellmigrationsabstand von der Docking-Struktur wie unten beschrieben berechnen. Siehe Abbildung 1C.
- Importieren Sie das Bild in die NIH ImageJ-Software (Version 1.45).
- Wählen Sie die Mitte jeder Zelle aus, die in den Verlaufskanal verschoben wurde.
- Messen Sie die Koordinaten der markierten Zellen für ihre Endpositionen. Messen Sie die Koordinate eines Punktes an der Kante der Andockstruktur als anfängliche Referenzposition.
- Exportieren Sie die gemessenen Koordinatendaten in eine Tabellenkalkulationssoftware (z. B. Excel). Berechnen Sie den Migrationsabstand der Zellen als Differenz zwischen der endgültigen Position einer Zelle und der anfänglichen Referenzposition entlang der Gradientenrichtung.
- Kalibrieren Sie den Abstand auf ein Mikrometer. Berechnen Sie den Durchschnitt und die Abweichung der Migrationsdistanz aller Zellen als Maß für die Chemotaxis.
- Vergleichen Sie die Migrationsdistanz in Gegenwart eines Chemolockstoffgradienten mit dem Medium Kontrollexperiment unter Verwendung des Student's t-Tests.
- Werden die Zeitrafferbilder der Zellmigration aufgenommen, können die Zellmigration und die Chemotaxis durch die Zellverfolgungsanalyse weiter analysiert werden.
Anmerkung: Die Materialien, die für die Konstruktion und Durchführung des All-on-Chip-Chemotaxis-Assays erforderlich sind, sind in der Materialtabelle aufgeführt.
