>1. Vorbereitung von Zielzellen, die rot fluoreszierendes Protein in ihren Zellkernen exprimieren
- Beziehen Sie eine Ziel-Maus-Krebszelllinie aus einer geeigneten Quelle.
Anmerkung: In diesem Protokoll wird ein hochmetastasiertes Derivat von E0771 Maus-Mammatumorzellen (E0771-LG) verwendet. Die elterlichen E0771-Zellen stammen von C57BL/6-Mäusen.
- Auftauen und Aufbewahren eines Fläschchens mit E0771-LG-Zellen mit Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) einschließlich 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS) in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2,
Anmerkung: Es sollte bestätigt werden, dass Zellen negativ für Mykoplasmen sind. Zu diesem Zweck werden E0771-Zellen (oder zu testende Zellen) wie oben beschrieben 2-3 Tage lang kultiviert (in Abwesenheit von Antibiotika und Antimykotika) und 500 μl Kulturmedium entnommen. Das Medium wird 60 s lang bei 12.419 x g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu beseitigen und den Überstand in neue Röhrchen zu überführen. Bestimmen Sie die Mykoplasmenkontamination mit einem handelsüblichen Mykoplasmen-Testkit (siehe Materialtabelle) und/oder PCR gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- 5 x 103 E0771-LG-Zellen pro Well in eine 12-Well-Platte aussäen und die Zellen mit 10 % (v/v) FBS-DMEM über Nacht in einem Inkubator bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2,
kultivieren
Anmerkung: Wenn die Proliferationsrate der Zielzellen niedrig ist (Verdopplungszeit der Population größer als 36 h), kann die Anzahl der Zellen auf 1 x 104 erhöht werden.
- Ersetzen Sie das Medium durch 1 mL 10 % (v/v) FBS-DMEM einschließlich 10 μg/mL Polybren und fügen Sie 25 μl lentivirale Partikel (1 x 106 TU/ml) hinzu, die für ein nukleär beschränktes rot fluoreszierendes Protein (mKate2, siehe Materialtabelle) kodieren.
- Kultivieren Sie die Zellen 24 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.
- Ersetzen Sie das Medium durch 10 % (v/v) FBS-DMEM und kultivieren Sie die Zellen 24-48 h lang in einem Inkubator bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.
- Ersetzen Sie das Medium durch 10 % (v/v) FBS-DMEM einschließlich 1 μg/ml Puromycin, wenn die Zellen beginnen, ein rot fluoreszierendes Protein zu exprimieren, und kultivieren Sie die Zellen, bis sie zu 80-90 % konfluent sind.
Anmerkung: Die Konzentration von Puromycin ist je nach Zielzelltyp unterschiedlich und sollte mit nicht transfizierten Zellen optimiert werden.
- Subkultur der überlebenden Zellen für 1-3 Passagen mit 10% (v/v) FBS-DMEM einschließlich 1 μg/mL Puromycin und Kryokonservierung der Bestände in einem Flüssigstickstoff-Dampfphasen-Lagersystem bis zur Verwendung.
>2. Isolierung von Suppressorzellen aus den Tumoren bei Mäusen
HINWEIS: In diesem Protokoll werden Suppressorzellen (d.h. Metastasen-assoziierte Makrophagen (MAMs) und monozytär-myeloische Suppressorzellen (M-MDSCs)) aus der Lunge isoliert, die metastasierende Tumoren enthalten, die von E0771-LG-Zellen etabliert wurden. Die Bedingungen für die Gewebedissoziation und Zellsortierung sollten optimiert werden, um die Zellen aus verschiedenen Geweben zu isolieren.
- Injizieren Sie 1 x 106 Krebszellen (E0771-LG) in die Schwanzvene von syngenen (C57BL/6), weiblichen, 7-10 Wochen alten Mäusen.
- Nach 14 Tagen isolieren Sie die Lunge mit metastasierenden Tumoren und bereiten einzellige Suspensionen aus der perfundierten Lunge durch enzymatischen Verdau her, wie zuvor beschrieben.
Anmerkung: Bei diesem Protokoll werden vier Mäusen Krebszellen injiziert und ihre metastasierenden Lungen kombiniert, um ausreichend Suppressorzellen zu erhalten.
- Inkubieren Sie die Einzelzellsuspensionen mit Anti-Maus-CD16/CD32-Antikörpern für 30 Minuten auf Eis und färben Sie sie mit fluoreszierenden Antikörpern gegen CD45, F4/80, CD11b, Ly6C und Ly6G (siehe Materialtabelle) für weitere 30 Minuten.
- Waschen Sie die gefärbten Zellen einmal mit 1 ml PBS mit 2 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 500–1000 μl PBS mit 2 % (w/v) BSA.
- Fügen Sie 3 μM DAPI hinzu und sortieren Sie M-MDSCs (DAPI-CD45+F4/80+Ly6G-CD11b hoch,Ly6Choch) und MAMs (DAPI-CD45+F4/80+Ly6G-CD11b hoch, Ly6Cniedrig) mit einem Zellsortierer (Abbildung 1).
Anmerkung: Der Schwellenwert des Ly6C-Spiegels zur Unterscheidung von MAMs (Ly6Clow) und M-MDSCs (Ly6Chigh) basiert auf dem Schwellenwert der residenten Alveolarmakrophagen (RMAC). Die Reinheit der sortierten Zellen wird mittels Durchflusszytometrie mit einer erwarteten Reinheit von mehr als 90% gemessen.
- Resuspendieren Sie die sortierten Zellen mit 400 μl DMEM, die 20 % (v/v) FBS, 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 1 % (v/v) nicht-essentielle Aminosäure, 1 mM Natriumpyruvat und 50 nM 2-Mercaptoethanol (als angereichertes DMEM, E-DMEM bezeichnet) enthalten.
- Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit der Trypanblau-Ausschlussmethode und stellen Sie sie mit E-DMEM auf 2 x 106 Zellen/ml ein.
- Bewahren Sie die Zellen bis zur Verwendung auf Eis auf.
>3. Isolierung von CD8+ T-Zellen aus der Milz von Mäusen
- Isolieren Sie die Milz von einer Maus, die syngenisch mit der Zielkrebszelllinie ist (d. h. C57BL/6 Mäuse in diesem Protokoll), wie folgt:
- Das Tier durch Einatmen von CO2 einschläfern.
- Legen Sie das Tier auf ein sauberes Sezierbrett und wischen Sie die Haut mit 70 % (v/v) Ethanol ab.
- Schneiden Sie die Bauchhaut mit einer Schere auf, um die Milz freizulegen
- Isolieren Sie die Milz, die sich unterhalb des Magens befindet, und legen Sie sie in ein Röhrchen mit 5 ml eiskaltem PBS.
- Mahlen Sie die Milz mit dem inneren Kolben einer sterilen 5-ml-Spritze auf einem 100-μm-Zellsieb auf einem 50-ml-Röhrchen.
- Führen Sie die Zellen mit insgesamt 10 mL PBS durch den Filter.
- Die Zellsuspension wird 5 min lang bei 337 x g zentrifugiert und der Überstand aspiriert.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL PBS mit 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0,5 % (w/v) BSA (Laufpuffer) und filtrieren Sie durch ein 40-μm-Zellsieb.
- Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen und stellen Sie sie mit dem Laufpuffer auf 1 x 108 Zellen/ml ein.
Anmerkung: Bewahren Sie ein kleines Aliquot der Zellen als Voranreicherungsprobe für eine Reinheitsprüfung auf.
- Anreicherung für CD8+ T-Zellen mit einem Negativ-Selektionskit und einem magnetischen Sortierer (siehe Materialtabelle).
- 1 x 108 (1 ml) der Splenozytenzellen werden in ein 5 ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden überführt.
- 50 μl biotinylierte Antikörper zugeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- 125 μl Streptavidin-konjugierte magnetische Kügelchen zugeben und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie 1,325 ml Laufpuffer hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren.
- Setzen Sie das Röhrchen in den Magneten ein und inkubieren Sie es 2,5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Nehmen Sie den Magneten auf und gießen Sie die angereicherte Zellsuspension in ein neues Röhrchen.
- Resuspendieren Sie die angereicherten Zellen mit 200 μl E-DMEM (d. h. DMEM mit 20 % (v/v) FBS, 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 1 % (v/v) nicht-essentieller Aminosäure, 1 mM Natriumpyruvat und 50 nM 2-Mercaptoethanol).
- Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen und stellen Sie sie mit E-DMEM auf 2 x 106 Zellen/ml ein. Bewahren Sie die Zellen bis zur Verwendung bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator auf.
Anmerkung: Bewahren Sie ein kleines Aliquot von Zellen als Probe nach der Anreicherung für eine Reinheitsprüfung auf.
- Bestimmen Sie die Reinheit von CD8+ T-Zellen durch Durchflusszytometrie wie folgt:
- Entnehmen Sie 1 x 104 Zellen aus Proben vor der Anreicherung (Schritt 3.6) oder nach der Anreicherung (Schritt 3.9) und stellen Sie das Gesamtvolumen jeder einzelnen Zellen mit einem Laufpuffer auf 100 μl ein.
- Inkubieren Sie die Einzelzellsuspensionen 30 Minuten lang mit Anti-Maus-CD16/CD32-Antikörpern auf Eis und färben Sie sie weitere 30 Minuten lang mit fluoreszierenden Antikörpern gegen CD45, CD3, CD4 und CD8 (siehe Materialtabelle).
- Waschen Sie die gefärbten Zellen mit 500 μl PBS mit 2 % (w/v) BSA und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 500–1000 μl PBS mit 2 % (w/v) BSA.
- Fügen Sie 3 μM 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) hinzu und bestimmen Sie den prozentualen Anteil von CD3+CD4-CD8+-Zellen an der gesamten CD45+-Zellpopulation.
>4. Aktivierung und Expansion der isolierten CD8+ T-Zellen
- Aliquotieren Sie 1 x 105 Zellen pro 50 μl CD8+ T-Zellen (hergestellt in Schritt 3.9) in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit U-Boden.
- 1 x 105 Zellen pro 50 μl Suppressorzellen (hergestellt in Schritt 2.7) oder 50 μl E-DMEM in die Vertiefungen geben.
- Bereiten Sie ein Aktivierungsmedium vor, das aus E-DMEM, 4 x 104 μg/ml Kolonie-stimulierendem Faktor 1 (CSF-1), 240 μg/ml Interleukin-2 (IL-2), 8 μg/ml Anti-Maus-CD3ε-Antikörper und 16 μg/ml Anti-Maus-CD28-Antikörper besteht.
Anmerkung: CSF-1 ist für die Aktivierung von T-Zellen nicht erforderlich, aber für das Überleben von Suppressorzellen in diesem Protokoll (d.h. MAMs und M-MDSCs) unerlässlich. Auf diese Weise wird es in der Co-Kultur von T-Zellen mit Zielkrebszellen beibehalten, um die Konsistenz unter Kulturbedingungen zu erhalten. Da CSF-1 in allen Geweben in nanomolaren Konzentrationen vorkommt und für die Lebensfähigkeit von Monozyten/Makrophagen in vivo erforderlich ist, ist dies ein physiologischer Kontext für diese Zellen.
Es - werden 50 μl Aktivierungsmedium (Schritt 4.3) und 50 μl E-DMEM mit oder ohne zu testende Reagenzien zugegeben.
- Stellen Sie die Platte bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 in einen Inkubator und kultivieren Sie die Zellen 4 Tage lang.
>5. Aufbau einer Co-Kultur von Zielzellen mit voraktivierten CD8+ T-Zellen
- Geben Sie 30 μl einer verdünnten Wachstumsfaktor-reduzierten löslichen Basalmembranmatrix (Materialtabelle) in die Vertiefungen der für die Mikroskopie geeigneten 96-Well-Platte mit flachem Boden und inkubieren Sie mindestens 1 h lang bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator.
- Bereiten Sie Zielzellen vor (d. h. E0771-LG-Zellen, die nukleär eingeschränktes rot fluoreszierendes Protein exprimieren).
- Inkubieren Sie die Zielzellen mit 1 ml 0,05 % Trypsin/EDTA 1 Minute lang bei Raumtemperatur und ernten Sie die Zellen durch schonendes Pipettieren.
- Fügen Sie 9 mL DMEM hinzu, einschließlich 10 % (v/v) FBS, und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 337 x g für 5 Minuten.
- Suspendieren Sie die Zellen erneut mit 500 μl E-DMEM und zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen.
Anmerkung: Bevor Sie die Zielzellen zählen, filtrieren Sie die Zellen durch ein 40-μm-Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
- Stellen Sie die Dichte durch Zugabe von E-DMEM auf 2 x 104 Zellen/ml (= 1 x 103 Zellen pro 50 μl) ein und halten Sie die Zellen auf Eis.
- Bereiten Sie Effektorzellen vor (d. h. voraktivierte CD8+ T-Zellen).
- Resuspendieren Sie die Zellen gründlich durch Pipettieren in einer Vertiefung einer 96-Well-Platte (Schritt 4.5) und überführen Sie die schwimmenden CD8+ T-Zellen in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
Anmerkung: MAMs und M-MDSCs haften fest an der Vertiefung und werden durch das Pipettieren nicht abgelöst.
- Um die restlichen Zellen zu sammeln, geben Sie 200 μl PBS in die Vertiefung und überführen Sie es in Schritt 5.3.1 in das Röhrchen.
- Waschen Sie die Zellen einmal mit 1 mL E-DMEM (zentrifugieren Sie bei 337 x g) für 5 min, aspirieren Sie und entsorgen Sie den Überstand) und resuspendieren Sie sie mit 100 μl E-DMEM.
- Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen (mit der Trypanblau-Ausschlussmethode), stellen Sie die Dichte auf 1,6 x 105 Zellen/ml (= 4 x 103 Zellen/25 μl) ein und halten Sie die Zellen auf Eis.
- Aspirieren Sie die Basalmembranmatrix aus jeder Vertiefung der Platte in Schritt 5.1.
- 1 x 103 Zellen/50 μl Zielzellen (Schritt 5.2.4) in jede Vertiefung geben und gut mischen.
Anmerkung: Um Kanteneffekte durch Verdampfung des Mediums zu vermeiden, sollten nur die inneren 60 Wells der 96-Well-Platte für die Analyse verwendet werden.
- Fügen Sie 25 μl E-DMEM hinzu, einschließlich 4 x 103 U/mL IL-2 und 10 μM fluorogenes Caspase-3-Substrat (siehe Materialtabelle).
- 4 x 103 Zellen/25 μl CD8+ T-Zellen (Schritt 5.3.4) in geeignete Vertiefungen geben und gut mischen.
Anmerkung: Das Vorhandensein von zu vielen Zellen in einer Vertiefung erschwert die Analyse. In diesem Modell war ein Effektor-Ziel-Verhältnis von 4:1 (Gesamtzellzahl 5 x 103 Zellen/Well) optimal, aber ein Verhältnis von 8:1 war suboptimal. Vertiefungen mit den folgenden vier Kontrollen sind erforderlich, um die Datenanalyse zu unterstützen: Zielzellen in der Dichte, die für die Co-Kultur-Wells verwendet wird (1 x 103 Zellen/Vertiefung) in Medium mit und ohne Caspase-3-Substrat, Effektorzellen (1 x 103 Zellen/Vertiefung) in Medium mit und ohne Caspase-3-Substrat.
- Geben Sie 200 μl PBS oder steriles Wasser in alle leeren Vertiefungen (insbesondere in die Vertiefungen am Rand der Platte), um die Verdunstung des Mediums aus den Versuchsvertiefungen zu reduzieren.
- Setzen Sie die Platte in ein Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskop ein, das bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2,
gehalten wird
Anmerkung: Schütteln Sie die Platte kreuzförmig, um alle Zellen gleichmäßig zu verteilen, und lassen Sie die Platte dann 10-20 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer ebenen Fläche stehen, bevor Sie sie in den Inkubator geben.
>6. Bildgebung der Zellen
HINWEIS: Die detaillierten Bildaufnahmeeinstellungen variieren je nach verwendetem Mikroskop und Fluorophoren; die folgenden allgemeinen Aufnahmeparameter sollten für optimale Ergebnisse verwendet werden.
- Nehmen Sie mit einer geeigneten Autofokus-Routine am Mikroskop Bilder auf, die mindestens 25 % der Gesamtoberfläche in jeder Versuchsvertiefung der 96-Well-Platte abdecken.
- Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es Bilder mit Phasenkontrast sowie einen Fluoreszenzkanal aufnimmt, der für das nuklearbeschränkte rote Fluoreszenzprotein (mKate2) geeignet ist, und einen Fluoreszenzkanal, der für das grüne fluorogene aktivierte Caspase-3-Substrat (mit Anregung bei 488 nm) geeignet ist (Abbildung 2).
- Nehmen Sie Bilder in experimentellen Vertiefungen im Phasenkontrast und in den 2 Fluoreszenzkanälen alle 1 bis 3 h für mindestens 72 h auf.
