Bewertung der Aktivierung multipler Caspasen in Makrophagen

Zusammenfassung

Quelle: Han, J. et al., Bewertung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des Zelltods des angeborenen Immunsystems.J. Vis. Exp.(2023)

Dieses Video zeigt die Bewertung mehrerer Caspase-Aktivierungen in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen durch Stimulation mit dem Influenzavirus. Nach der Makrophagenlyse, der Hitzeinaktivierung von Lysat und der Zentrifugation werden intrazelluläre Caspasen für die anschließende immunologische Analyse gesammelt.

Protokoll

>1. Vorbereiten der Lösungen

1. Bereiten Sie L929-konditionierte Medien vor.
   1. Platte 1 × 10⁶ L929-Zellen (siehe Materialtabelle) in einem 182 cm^großen 2-Gewebekulturkolben mit 50 ml L929-Kulturmedium (siehe Tabelle 1 zur Herstellung des Mediums).
   2. Züchten Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid, CO₂.
   3. Nach 7 Tagen wird der Überstand aufgefangen und mit einem 0,45-μm-Filter filtriert. Bereiten Sie 50-ml-Aliquots vor (gefrorene Aliquots bis zu 1 Jahr bei -80 °C lagern).
2. Bereiten Sie 500 ml Kulturmedien aus Knochenmark-Makrophagen (BMDM) vor (Tabelle 1).
3. Bereiten Sie 500 ml BMDM-Stimulationsmedium vor (Tabelle 1).
4. Bereiten Sie 500 ml Medium für die Infektion vor (Tabelle 1).
5. Bereiten Sie 100 ml 1 M Tris-Puffer vor (Tabelle 1).
6. Bereiten Sie 4x Natriumdodecylsulfat (SDS)-Puffer vor (Tabelle 1).
7. 1 ml 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT, Tabelle 1) bereiten.
8. Bereiten Sie 40 ml Caspase-Lysepuffer vor (Tabelle 1).
9. Bereiten Sie 100 ml 1,5 M Tris-Puffer vor (Tabelle 1).
10. Bereiten Sie 100 ml einer 10%igen (wt/vol) SDS-Lösung vor (Tabelle 1).
11. Bereiten Sie 50 ml eines 2x Radioimmunpräzipitationsassays (RIPA) Puffers vor (Tabelle 1).
12. Bereiten Sie eine LPS-Lösung mit 5 mg/ml Lipopolysaccharid vor (Tabelle 1).
13. Bereiten Sie eine 0,5 M Adenosintriphosphat, ATP-Lösung vor (Tabelle 1).
14. Bereiten Sie die Western-Blotting-Lösungen vor.
    1. Bereiten Sie 1 l 5x laufendes Pufferlager vor (Tabelle 1).
    2. Bereiten Sie 1 l 10x Transferpuffer vor (Tabelle 1).
    3. Bereiten Sie 1 l Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 vor (TBST, Tabelle 1).
    4. Bereiten Sie 100 ml einer 5%igen Magermilchblocklösung vor (Tabelle 1).
15. Bereiten Sie die primären Antikörperlösungen vor.
    1. Bereiten Sie 10 ml Caspase-1-Primärantikörper vor (Tabelle 1).
    2. Bereiten Sie 10 ml Caspase-11-Primärantikörper vor (Tabelle 1).
    3. Bereiten Sie 10 ml Caspase-3-Primärantikörper vor (Tabelle 1).
    4. Bereiten Sie 10 ml Caspase-7-Primärantikörper vor (Tabelle 1).
    5. Bereiten Sie 10 ml Caspase-8-Primärantikörper vor (Tabelle 1).
    6. Bereiten Sie 10 ml Caspase-9-Primärantikörper vor (Tabelle 1).
    7. Bereiten Sie 10 ml HRP-konjugierten β-Aktin-Primärantikörper vor (Tabelle 1).
16. Bereiten Sie die Sekundärantikörperlösungen vor.
    1. Bereiten Sie 10 ml Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper vor (Tabelle 1).
    2. Bereiten Sie 10 ml einen Anti-Maus-Sekundärantikörper vor (Tabelle 1).
    3. Bereiten Sie 10 ml Anti-Ratten-Sekundärantikörper vor (Tabelle 1).

>2. Isolierung von Makrophagen aus dem Knochenmark

HINWEIS: Für dieses Protokoll können 6-10 Wochen alte Wildtyp-Mäuse mit intakten PCD-Signalwegen (Programmed Cell Death) oder mutierte Mäuse verwendet werden, bei denen die PCD-Regulatoren, Effektoren oder Moleküle von Interesse gelöscht oder verändert wurden.

1. Euthanasieren Sie eine Maus in einer CO_{2 -}Kammer mit einer Flussrate, die 10%-30% des Käfigvolumens pro Minute für 2-3 Minuten verdrängt. Führen Sie dann eine sekundäre Euthanasiemethode durch, z. B. eine Gebärmutterhalsluxation. Befolgen Sie alle zusätzlichen einrichtungs-, institutions- und behördlichen Richtlinien und Vorschriften, sofern zutreffend.
2. Präpariere die Maus, um die Knochen der Hinterbeine zu bergen.
   1. Stecken Sie die Maus auf den Rücken, so dass der Bauch freiliegt. Mit 70% (vol/vol) Ethanol besprühen, um die Hinterbeine und den Bauch zu sterilisieren.
      Vorsicht: Ethanol ist brennbar. Halten Sie es von offenen Flammen fern.
   2. Mache mit einer Schere einen Schnitt an der Mittellinie des Bauches; schneide weiter in Richtung der Beine, um die Oberschenkelknochen sichtbar zu machen.
   3. Nimm das rechte hintere Bein und ziehe die Haut vom Körper weg in Richtung Mittellinie. Das Bein vom Körper lösen, indem die Adduktorenmuskeln in Richtung Mittellinie durchtrennt werden; Schneiden Sie dann das Bein zwischen Hüftgelenk und Wirbelsäule ab. Schneiden Sie als Nächstes die Pfote distal zum Knöchel ab und entfernen Sie überschüssiges Gewebe vom Knochen, indem Sie die Haut abziehen und mit einer leicht geöffneten Schere das Wadengewebe entfernen.
   4. Legen Sie das Bein auf ein mit 70 % (vol/vol) Ethanol getränktes Handtuch und präparieren Sie das Schienbein und den Oberschenkelknochen.
      1. Fassen Sie das Schienbein und den Oberschenkelknochen jeweils mit einer separaten Pinzette zusammen. Drücken Sie das Schienbein sanft gegen die natürliche Richtung des Kniegelenks. Dies führt dazu, dass das Schienbein am Knie bricht.
      2. Verwenden Sie bei Bedarf die Pinzette und die Präparierschere, um das verbleibende hängende Gewebe zu entfernen. Bewahren Sie das Schienbein für den späteren Gebrauch auf, indem Sie es auf das mit Ethanol getränkte Handtuch legen.
      3. Sammeln Sie den Oberschenkelknochen auf die gleiche Weise, indem Sie das Knie abbrechen.
   5. Wiederholen Sie die obigen Schritte 3 und 4 für das linke Bein, um es aus dem Körper zu entfernen und das Schienbein und den Oberschenkelknochen zu präparieren.
   6. Besprühen Sie die Knochen mit 70% (vol/vol) Ethanol.
   7. Reinigen Sie die Knochen, indem Sie sie auf ein sauberes, mit 70 % Ethanol getränktes Handtuch legen, den fleischigen Teil im Handtuch zusammendrücken und das Handtuch gegen den Knochen reiben, um überschüssiges Gewebe zu entfernen.
3. Sobald beide Oberschenkelknochen und beide Schienbeine sauber sind, besprühen Sie alle vier Knochen mit 70 % (vol/vol) Ethanol. Sammeln Sie die Knochen in einer sterilen Petrischale und spülen Sie sie mit 10 ml BMDM-Nährmedien ab, indem Sie das Medium vorsichtig in der Schale schwenken.
4. Füllen Sie eine 10-ml-Spritze mit 10 mL frischem BMDM-Nährmedium und setzen Sie eine 25-g-Nadel ein.
5. Nehmen Sie das Schienbein mit einer Pinzette auf und schneiden Sie dann das Sprunggelenk in einem Winkel von ~45°
.
6. Spülen Sie das Knochenmark aus dem Schienbein.
   1. Halten Sie das Schienbein über ein 50-ml-Röhrchen, wobei das schmale Ende des Schienbeins nach unten zeigt. Geben Sie das Medium aus der gefüllten Spritze über das Schienbein ab.
   2. Führen Sie die Nadel (zunächst vorsichtig) am oberen Ende des Knochenmarks ein und geben Sie das Medium ab.
   3. Entfernen Sie die Nadel und stechen Sie sie erneut ein. Dosieren Sie das Medium mit kurzem, hohem Druck und bewegen Sie die Nadel in das Mark.
   4. Sobald das Medium aus der Unterseite des Knochens herauszufließen beginnt, verwenden Sie kurze Druckstöße, um die Zellen weiter auszuspülen. Überwachen Sie die Farbe des Knochens während dieses Prozesses, und wenn der Knochen weiß ist, entsorgen Sie ihn.
   5. Tun Sie dies für beide Tibias.
7. Wiederholen Sie die obigen Schritte 5 und 6 für die Oberschenkelknochen und schneiden Sie am Hüftgelenk, so wie das Schienbein am Sprunggelenk geschnitten wurde. Verwenden Sie dasselbe 50-ml-Röhrchen, um das BMDM-Kulturmedium zu entnehmen, während das Knochenmark gespült wird.
8. Sobald alle vier Knochen gespült wurden, aspirieren Sie das Knochenmark und das Medium aus dem 50-ml-Röhrchen 3x durch eine 18-G-Nadel auf einer 10-ml-Spritze auf und ab und spülen Sie jedes Mal die Seiten des Röhrchens, um das Knochenmark zu dispergieren.
9. Passen Sie das endgültige Volumen im 50-ml-Röhrchen mit BMDM-Kulturmedien auf 30 mL an und stellen Sie sicher, dass die Zellen gründlich suspendiert sind.
10. Verwenden Sie ein 70-μm-Zellsieb, um das BMDM-Kulturmedium aus dem 50-ml-Röhrchen zu filtern.
11. Die resultierende Zellsuspension, die die Knochenmarkvorläuferzellen enthält, wird in drei 150-mm-Gewebekulturschalen gegeben, indem jeweils 10 ml (oder ~20 × 10⁶ Zellen) hinzugefügt werden. Geben Sie dann weitere 10 ml BMDM-Nährmedien in jede Schale. Inkubieren Sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C.

>3. Differenzierung der BMDMs und Plattierung für die Experimente

1. Inkubieren Sie die plattierten Knochenmarkvorläuferzellen 3 Tage lang bei 37 °C. Entfernen Sie dann jede Schale und fügen Sie weitere 5-8 ml BMDM-Kulturmedien hinzu (Tabelle 1). Kehren Sie bei 37 °C in den Inkubator zurück.
2. Entfernen Sie am 5. Tag nach der ersten Beschichtung jede Schale und fügen Sie weitere 5 ml BMDM-Nährmedium hinzu. Kehren Sie bei 37 °C in den Inkubator zurück.
3. Nehmen Sie an Tag 6 jede Schale heraus und entsorgen Sie das Medium. Fügen Sie dann 10 ml kalte (bei 4 °C gelagerte) phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu, um sie einmal zu waschen. Entsorgen Sie die 10 ml kalte PBS-Wäsche. Geben Sie dann 10 ml frisches, kaltes PBS in jede Schale und inkubieren Sie jede Schale 5 Minuten lang auf Eis.
4. Kratzen Sie die Zellen mit einem Zellschaber vorsichtig von allen drei Schalen in ein 50-ml-Röhrchen. Schleudern Sie die Zellen bei 270 × g bei 4 °C 5 Minuten lang sanft herunter; Entsorgen Sie dann den Überstand.
5. Geben Sie 20 ml BMDM-Nährmedium hinzu, pipettieren Sie auf und ab, um das Pellet zu resuspendieren, und zählen Sie die Zellen.
   Anmerkung: Es wird erwartet, dass jede Maus etwa 60 × 10 6-100 × 10⁶ Zellen liefert.
6. Planen Sie das 12-Well-Plattenlayout für den gewünschten In-vitro-Zelltod-/Entzündungsstimulations-Assay. Planen Sie, 1 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung zu plattieren. Für jede geplante Stimulation sind mindestens drei biologische Replikate einzuschließen und ein Satz von Vertiefungen, die in Caspase-Lysepuffer geerntet werden sollen, und ein zweiter Satz von Vertiefungen, die in RIPA-Puffer geerntet werden sollen, zu plattieren.
7. Platte 1 × 10:⁶ Zellen in 1 ml BMDM-Nährmedium pro Well, in 12-Well-Platten. Über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C kultivieren, bevor mit der Bewertung des Zelltods/der Entzündung fortgefahren wird. Entfernen Sie nach der Inkubation über Nacht das Medium und geben Sie 1 ml warmes (37 °C) PBS in jede Vertiefung, um die Zellen zu waschen.
8. Entfernen Sie die PBS-Wäsche und fügen Sie 500 μl BMDM-Stimulationsmedien mit Antibiotika (bei nicht-bakteriellen Stimulationen) oder BMDM-Stimulationsmedien ohne Antibiotika (bei bakteriellen Stimulationen) hinzu (Tabelle 1). 2 Stunden inkubieren, bevor Sie mit Schritt 4 für die In-vitro-Stimulation/Infektion fortfahren.

>4. Stimulieren oder infizieren der Zellen

VORSICHT: Die in diesem Protokoll enthaltenen Wirkstoffe sind potenziell pathogen und sollten mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) mit Genehmigung der zuständigen institutionellen und staatlichen Behörden gehandhabt werden.

1. Stimulieren Sie die BMDMs, den Zelltod mit dem Trigger of Interest zu aktivieren.
   Anmerkung: Für die Zwecke dieses Protokolls werden das Influenza-A-Virus (IAV), das Herpes-simplex-Virus 1 (HSV1), Francisella novicida und LPS + ATP zur Veranschaulichung verwendet, aber es können auch andere Auslöser verwendet werden.
   1. Beispiel für Stimulation 1: Infizieren mit IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) (konstruiert nach Hoffmann et al.; der virale Titer für die Bestimmung der Multiplizität der Infektion [MOI] wird durch einen Plaque-Assay in MDCK-Zellen berechnet):
      1. Berechnen Sie das für eine Infektion erforderliche Virusvolumen bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 20 plaquebildenden Einheiten (PFU) unter Verwendung von Gleichung (1) und Gleichung (2):
         
         
         
   2. Entfernen Sie das Medium aus den BMDMs und waschen Sie die Zellen einmal mit 500 μl PBS. Geben Sie 450 μl IAV (20 MOI) in DMEM mit hohem Glukosegehalt ohne hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (HI)-FBS in jede Vertiefung. Die Platten werden 1 h lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert, um die Absorption zu ermöglichen.
   3. Entfernen Sie die Platten und fügen Sie 50 μl HI-FBS hinzu. Die Platten wieder bei 37 °C in den Inkubator stellen und insgesamt 12 Stunden inkubieren.

>5. Sammeln des kombinierten Überstands und des Proteinlysats zur Verwendung für Caspase-Western-Blots

1. Nach 4 h, 12 h oder 16 h Inkubation (der genaue Zeitpunkt hängt vom verwendeten Auslöser ab) nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator.
2. Entfernen Sie 150 μl des Überstands; entsorgen Sie ihn oder bewahren Sie ihn für andere Überstandsanalysen auf (z. B. Enzyme-linked Immunosorbent Assay [ELISA]). Entfernen Sie nicht den restlichen Überstand.
3. Stellen Sie die Proteinsammellösung her, indem Sie 50 μl Caspase-Lysepuffer + 100 μl 4x SDS-Puffer pro Vertiefung kombinieren (Tabelle 1). Geben Sie dann 150 μl der Mischung in jede Vertiefung
.
4. Pipettieren Sie die Mischung für jede Vertiefung auf und ab, um die lysierten Zellen und den Überstand zu sammeln. Kratzen Sie beim Pipettieren auch mit der Pipettenspitze den Boden der Vertiefung ab, um die Zellen aufzubrechen. Sammeln Sie das Proteinlysat nach dem Schaben und Pipettieren in markierten 1,5-ml-Röhrchen.
5. Verwenden Sie einen Heizblock, um alle Rohre 12 Minuten lang auf 100 °C zu erhitzen.
6. Unlösliche Bestandteile werden durch Zentrifugieren bei 14.500 × g für 30 s bei Raumtemperatur pelletiert.
   HINWEIS: Hierbei handelt es sich um einen Pausenpunkt - das Protein aus dem kombinierten Überstand und den Proteinlysaten kann entweder sofort verwendet oder bis zu 2 Monate bei -20 °C oder bis zu 6 Monate bei -80 °C bis zur Gebrauchsverwendung gelagert werden.

Kategorie	reagenzien	Präparat	Bemerkungen	sicherheitsvorkehrungen
Medien	L929 Nährmedien	1) FBS hitzeinaktivieren (siehe Bemerkungen). 2) Kombinieren Sie 43,5 ml modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM) von Iscove, 5 ml hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (HI-FBS), 0,5 ml Natriumpyruvat, 0,5 ml nicht-essentielle Aminosäuren und 0,5 ml Penicillin und Streptomycin.	FBS hitzeinaktivieren, indem es 30 Minuten lang bei 56 °C inkubiert.
	Kulturmedien für aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen (BMDM)	Kombinieren Sie 290 ml IMDM, 150 ml L929-konditionierte Medien und 5 ml nicht-essentielle Aminosäuren, 50 ml HI-FBS und 5 ml Penicillin und Streptomycin.	Erwärmen Sie das Medium vor Gebrauch in einem Wasser- oder Perlbad auf 37 °C. Die Medien können bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.
	BMDM Stimulationsmedien mit Antibiotika	Kombinieren Sie 445 ml Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 50 ml HI-FBS und 5 ml Penicillin und Streptomycin.	Erwärmen Sie das Medium vor Gebrauch in einem Wasser- oder Perlbad auf 37 °C. Die Medien können bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.
	BMDM Stimulationsmedien ohne Antibiotika	Kombinieren Sie 450 mL DMEM und 50 mL HI-FBS.	Erwärmen Sie das Medium vor Gebrauch in einem Wasser- oder Perlbad auf 37 °C. Die Medien können bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.
	Medien für Infektionen (kein HI-FBS)	Kombinieren Sie 495 ml DMEM mit hohem Glukosegehalt mit 5 ml Penicillin und Streptomycin.	Erwärmen Sie das Medium vor Gebrauch in einem Wasser- oder Perlbad auf 37 °C. Die Medien können bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.
Natriumdodecylsulfat (SDS) Puffer	1 M Tris Puffer (für 4x SDS-Puffer)	1) 12,11 g Tris in 80 mL entionisiertem Wasser auflösen. 2) Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 ein, indem Sie unter Rühren Tropfen HCl hinzufügen. 3) Fügen Sie entionisiertes Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 100 ml einzustellen.	Der Puffer kann bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.	HCl ist ätzend. Tragen Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung; Dazu gehören ein Laborkittel und Handschuhe. HCl sollte in einem Abzug gehandhabt werden.
	4x SDS-Puffer	1) Kombinieren Sie 60 ml 1 M Tris-Lösung (pH 6,8), 24 mg SDS, 100 mg Bromphenolblau, 120 ml Glycerin, 8,4 ml β-Mercaptoethanol (BME) und 90 ml entionisiertes Wasser. 2) Rühren Sie auf einer wärmenden Rührplatte um, damit Salze in die Lösung gelangen können. 3) Fügen Sie entionisiertes Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 300 ml einzustellen.	Der Puffer kann aliquotiert und bis zu 1 Jahr bei -20 °C gelagert werden.	SDS ist ätzend und BME krebserregend. Tragen Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung; Dazu gehören ein Laborkittel und Handschuhe. SDB und BME sollten in einem Abzug gehandhabt werden.
Caspase-Lysepuffer	1 M 1,4-Dithiothreitol (DVB-T)	0,154 g DTT-Pulver in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auflösen. Lassen Sie DTT in die Lösung gelangen.	Der Puffer kann in 200-μl-Aliquoten aliquotiert und bis zu 1 Jahr bei -20 °C gelagert werden.
	Caspase-Lyse-Puffer	Kombinieren Sie 35 ml deionisiertes Wasser, 4 ml NP-40, 750 μl 1 M DTT, 1 Proteasehemmer-Tablette und 1 Phosphatase-Hemmer-Tablette.	Der Puffer kann bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
Puffer für Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA)	1,5 M Tris Puffer (für RIPA-Puffer)	1) 18,2 g Tris in 80 mL entionisiertem Wasser auflösen. 2) Stellen Sie den pH-Wert auf 8,8 ein, indem Sie unter Rühren Tropfen NaOH hinzufügen. 3) Fügen Sie entionisiertes Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 100 ml einzustellen.	Der Puffer kann bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.	NaOH ist ätzend und kann Verbrennungen verursachen. Tragen Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung; Dazu gehören ein Laborkittel und Handschuhe.
	10 % (Gew./Vol.) SDB-Lösung (für RIPA-Puffer)	1) Geben Sie 10 g SDS zu 80 mL deionisiertem Wasser. 2) Rühren, bis es sich aufgelöst hat. 3) Fügen Sie entionisiertes Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 100 ml einzustellen.	Die Lösung kann bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden. Wenn die Lösung ausfällt, erhitzen Sie sie vorsichtig, um sie wieder aufzulösen.	SDS ist ätzend. Tragen Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung; Dazu gehören ein Laborkittel und Handschuhe. Sicherheitsdatenblätter sollten in einem Abzug gehandhabt werden.
	RIPA-Puffer (2x Lager)	1) Kombinieren Sie 0,5 g Natriumdesoxycholat, 1 ml NP-40, 0,876 g NaCl, 3,3 ml 1,5 M Tris (pH 8,8) und 1 ml 10 % (Gew./vol) SDS in 46 ml deionisiertem Wasser. 2) Rühren, bis es sich aufgelöst hat. 3) Fügen Sie entionisiertes Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 50 ml einzustellen.	2x RIPA-Ware kann bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.	SDS ist ätzend. Tragen Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung; Dazu gehören ein Laborkittel und Handschuhe. Sicherheitsdatenblätter sollten in einem Abzug gehandhabt werden.
Sterile Auslöser	Lps	Löse lyophilisiertes LPS aus E. coli 0111:B4 in endotoxinfreiem Wasser bis zu einer Konzentration von 5 mg/ml.	Die Lösung kann bis zu 2 Jahre bei -20 °C gelagert werden.
	0,5 M ATP	1 g lyophilisiertes ATP in 3,63 ml endotoxinfreiem Wasser auflösen.	Die Lösung kann aliquotiert und bis zu 2 Jahre bei -20 °C gelagert werden.
Western Blotting-Lösungen	Ausführen von buffer (5x Lagerbestand)	1) Kombinieren Sie 15 g Tris-Base, 72 g Glycin und 5 g SDS in 900 ml deionisiertem Wasser. 2) Rühren, bis keine Partikel mehr übrig sind. 3) Fügen Sie entionisiertes Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 1 l einzustellen.	Der Puffer kann bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.	SDS ist ätzend. Tragen Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung; Dazu gehören ein Laborkittel und Handschuhe. Sicherheitsdatenblätter sollten in einem Abzug gehandhabt werden.
	Puffer übertragen (10x Lager)	1) Kombinieren Sie 30,3 g Tris-Base und 72 g Glycin in 900 ml entionisiertem Wasser. 2) Rühren, bis keine Partikel mehr übrig sind. 3) Fügen Sie entionisiertes Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 1 l einzustellen.	Der Puffer kann bis zu 3 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
	Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST)	1) 2,42 g Tris-Base und 8,76 g NaCl in 850 mL deionisiertem Wasser auflösen. 2) Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, indem Sie unter Rühren Tropfen HCl hinzufügen. 3) Fügen Sie entionisiertes Wasser hinzu, um das Endvolumen auf 1 L. einzustellen 4) Fügen Sie 0,5 mL Tween 20 hinzu (Endkonzentration von 0,05 % (vol/vol)).	Die Lösung kann 1 Monat lang bei Raumtemperatur gelagert werden.	HCl ist ätzend. Tragen Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung; Dazu gehören ein Laborkittel und Handschuhe. HCl sollte in einem Abzug gehandhabt werden.
	5 % (Gew./vol) Magermilch-Blockierungslösung	5 g fettfreies Trockenmilchpulver in 100 ml TBST auflösen.	Die Lösung kann bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.
Primäre Antikörper	Caspase-1 primärer Antikörper	Verdünnen Sie den Anti-Caspase-1-Antikörper 1:1.000 (vol/vol), indem Sie 10 μl des Antikörpers zu 10 ml 5 % (wt/vol) Magermilchblockierungslösung hinzufügen.	Für optimale Ergebnisse für jedes Experiment frisch machen. Diese Lösung kann jedoch mindestens 3 Mal verwendet werden, ohne dass die Wirksamkeit verloren geht. Bei Wiederverwendung bei -20 °C lagern.
	Caspase-11 primärer Antikörper	Verdünnen Sie den Anti-Caspase-11-Antikörper 1:1.000 (vol/vol), indem Sie 10 μl des Antikörpers zu 10 ml 5 % (wt/vol) Magermilchblockierungslösung hinzufügen.	Für optimale Ergebnisse für jedes Experiment frisch machen. Diese Lösung kann jedoch mindestens 3 Mal verwendet werden, ohne dass die Wirksamkeit verloren geht. Bei Wiederverwendung bei -20 °C lagern.
	Caspase-3 primärer Antikörper	Verdünnen Sie den Anti-Caspase-3-Antikörper und den gespaltenen Caspase-3-Antikörper 1:1.000 (vol/vol), indem Sie 10 μl jedes Antikörpers zu denselben 10 ml 5 % (Gew./vol) Magermilchblockierungslösung hinzufügen.	Für optimale Ergebnisse für jedes Experiment frisch machen. Diese Lösung kann jedoch mindestens 3 Mal verwendet werden, ohne dass die Wirksamkeit verloren geht. Bei Wiederverwendung bei -20 °C lagern.
	Caspase-7 primärer Antikörper	Verdünnen Sie den Anti-Caspase-7-Antikörper und den gespaltenen Caspase-7-Antikörper 1:1.000 (vol/vol), indem Sie 10 μl jedes Antikörpers zu denselben 10 ml 5 % (Gew./vol) Magermilchblockierungslösung hinzufügen.	Für optimale Ergebnisse für jedes Experiment frisch machen. Diese Lösung kann jedoch mindestens 3 Mal verwendet werden, ohne dass die Wirksamkeit verloren geht. Bei Wiederverwendung bei -20 °C lagern.
	Caspase-8 primärer Antikörper	Verdünnen Sie den Anti-Caspase-8-Antikörper und den gespaltenen Caspase-8-Antikörper 1:1.000 (vol/vol), indem Sie 10 μl jedes Antikörpers zu denselben 10 ml 5%iger (wt/vol) Magermilchblockierungslösung hinzufügen.	Für optimale Ergebnisse für jedes Experiment frisch machen. Diese Lösung kann jedoch mindestens 3 Mal verwendet werden, ohne dass die Wirksamkeit verloren geht. Bei Wiederverwendung bei -20 °C lagern.
	Caspase-9 primärer Antikörper	Verdünnen Sie den Anti-Caspase-9-Antikörper 1:1.000 (vol/vol), indem Sie 10 μl des Antikörpers zu 10 ml 5 % (wt/vol) Magermilchblockierungslösung hinzufügen.	Für optimale Ergebnisse für jedes Experiment frisch machen. Diese Lösung kann jedoch mindestens 3 Mal verwendet werden, ohne dass die Wirksamkeit verloren geht. Bei Wiederverwendung bei -20 °C lagern.
	HRP-konjugierter β-Aktin-Primärantikörper	Verdünnen Sie den Anti-β-Aktin-Antikörper 1:5.000 (vol/vol), indem Sie 2 μl des Antikörpers zu 10 ml 5 % (wt/vol) Magermilchblockierungslösung hinzufügen.	Dieser Antikörper sollte für jedes Experiment frisch zubereitet werden.
Sekundäre Antikörper	Anti-Kaninchen-Antikörper	Verdünnen Sie den Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper 1:5.000 (vol:vol), indem Sie 2 μl des Antikörpers zu 10 ml 5%iger (wt/vol) Magermilchblockierungslösung hinzufügen.	Die Antikörperverdünnung sollte jedes Mal frisch zubereitet werden.
	Anti-Maus-Antikörper	Verdünnen Sie den HRP-konjugierten Sekundärantikörper 1:5.000 (vol:vol), indem Sie 2 μl des Antikörpers zu 10 ml 5 % (wt/vol) Magermilchblockierungslösung hinzufügen.	Die Antikörperverdünnung sollte jedes Mal frisch zubereitet werden.
	Anti-Ratten-Antikörper	Verdünnen Sie den HRP-konjugierten Sekundärantikörper 1:5.000 (vol:vol), indem Sie 2 μl des Antikörpers zu 10 ml 5 % (wt/vol) Magermilchblockierungslösung hinzufügen.	Die Antikörperverdünnung sollte jedes Mal frisch zubereitet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,45 μm Filter	Millipore	SCHVU05RE
10 mL Spritze	BD Biowissenschaften	309604
12-Well-Platte	Corning	Tel.: 07-200-82
18 G Nadel	BD Biowissenschaften	305195
25 G Nadel	BD Biowissenschaften	305122
50 mL Röhrchen	Fisher Scientific	Tel.: 50-809-218
70 μm Zellsieb	Corning	431751
150 mm Gewebekulturschalen	Corning	430597
182 cm2 Gewebekulturkolben	Genesee Scientific	Nr. 25-211
Atp	InvivoGen	tlrl-atpl
BBL Trypticase Sojabrühe	BD Biowissenschaften	211768
Perlenbad	Chemglass Biowissenschaften	Artikel-Nr.: CLS-4598-009
Biophotometer D30	Eppendorf	6133000010
Zell-Abstreifer	CellTreat Scientific Produkte	229315
CO2-Kammer	VetEquip	901703
Küvetten	Fisher Scientific	Tel.: 14-955-129
Präparierschere	Thermo Fisher Scientific	221S
DMEM	Thermo Fisher Scientific	Nr. 11995-073
Ethanol	Pharmco	111000200
Fötales Rinderserum	Biowest (Biowesten)	Nr. S1620
Filterpapier	Bio-Rad	1703965
Zange	Fisher Scientific	Tel.: 22-327379
Francisella novicida (Stamm U112)	BEI Ressourcen	NR-13
Gentamycin	Gibco	15750060
Heizblock	Fisher Scientific	Tel.: 23-043-160
Herpes-simplex-Virus 1 (HF-Stamm)	ATCC	VR-260
Hoher Glukose-DMEM	Sigma	Nr. D6171
Befeuchteter Inkubator	Thermo Fisher Scientific	51026282
IMDM	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 12440-053
Influenza-A-Virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])	konstruiert nach Hoffmann et al.
L929-Zellen	ATCC	CCL-1	Zelllinie zur Herstellung von L929-konditionierten Medien
L-Cystein	Thermo Fisher Scientific	Nr. BP376-100
MDCK-Zellen	ATCC	CCL-34	Zelllinie zur Bestimmung des IAV-Virustiters
Mikrozentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002401
Nicht-essentielle Aminosäuren	Gibco	11140050
NP-40 Lösung	Sigma	492016
Pbs	Thermo Fisher Scientific	10010023
Penicillin und Streptomycin	Sigma	Nr. P4333
Petrischale	Fisher Scientific	Tel.: 07-202-011
PhosSTOP	Roche	PHOSS-RO
Stromquelle	Bio-Rad	Tel.: 164-5052
Proteasehemmer Tablette	Sigma	Nr. S8820
Natriumhydroxid	Sigma	Artikel-Nr.: 72068
Natriumpyruvat	Gibco	Artikel-Nr.: 11360-070
Quadratische Petrischale	Fisher Scientific	FB0875711A
Tischzentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75004524
Hochreines Lipopolysaccharid (LPS) aus E. coli 0111:B4	InvivoGen	tlrl-3pelps
Vero-Zellen	ATCC	CCL-81	Zelllinie zur Bestimmung des HSV1-Virustiters