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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Analyse von Tränenzytokinen
- Sammlung von Tränen:
- Bitten Sie den Probanden, bequem auf einem Untersuchungsstuhl zu sitzen und den Kopf gegen die Kopfstütze zu legen.
- Bitten Sie das Subjekt, nach oben zu schauen, öffnen Sie vorsichtig die Schirmer-Streifen (aus Whatman-Filterpapier Nr. 41), legen Sie das abgerundete Ende des Streifens auf den unteren Fornix des Auges und weisen Sie das Subjekt an, die Augen für 5 Minuten zu schließen. Achten Sie beim Sammeln der Tränen sehr darauf, den Kontakt mit der Augenoberfläche zu minimieren.
- Bitten Sie den Probanden, die Augen zu öffnen, um den Streifen zu entfernen und ihn in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu legen. Bringen Sie das Röhrchen sofort ins Labor oder lagern Sie es bei -80 °C, bis es für die Zytokinprofilierung getestet wird.
- Elution der Tränenprobe aus dem Tränenflussstreifen:
- Schneiden Sie den Tränenflussstreifen auf eine Länge von 0,5 cm ab (um die Anzahl der zu testenden Risse zu standardisieren) und legen Sie ihn in ein steriles 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie 30 μl Assay-Puffer hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Zentrifugation des Röhrchens bei 14.000 x g für 1 Minute.
- Den Überstand in ein weiteres 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und den Streifen entsorgen. Legen Sie die Probe mit dem Röhrchen auf Eis und verwenden Sie die eluierte Tränenprobe sofort für die Erstellung von Zytokinprofilen.
- Vorbereitung der Reagenzien:
HINWEIS: Die einundvierzig Analyten, die in jeder Probe mittels Bead-basiertem Multiplex-Assay getestet werden sollen, sind Interleukin (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, Interferon-alpha (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-gamma-induzierbares Protein 10 (IP-10, CXCL10), Makrophagen-abgeleitetes Chemokin (MDC), Makrophagen-Entzündungsprotein (MIP)-1α und MIP-1β, Monozyten-Chemotaktisches Protein (MCP)-1, MCP-3, Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), TNF-β, wachstumsreguliertes Onkogen (GRO), Tumorwachstumsfaktor alpha (TGF-α), vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)-2, Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Eotaxin, Fractalkin, löslicher CD40-Ligand (sCD40L), Fms-ähnlicher Tyrosinkinase-3-Ligand (Flt-3L) und bei Aktivierung reguliertes normales T-Zell-exprimiertes und sezerniertes Protein (RANTES).
- Bringen Sie die Fläschchen mit Antikörper-Bead-Lösung (50X) auf Raumtemperatur (20 – 25 °C) und wirbeln Sie die Fläschchen 1 Minute lang ein.
- Zählen Sie die Anzahl der für den Assay erforderlichen Wells und berechnen Sie die Menge der gesamten Antikörperbead-Cocktaillösung (25 μl pro Well) und jeder für den Assay erforderlichen Antikörperbead-Lösung (50X).
- Bereiten Sie die Cocktaillösung vor, indem Sie die berechnete Menge jeder Antikörperperlenlösung hinzufügen, und füllen Sie sie auf das gewünschte Endvolumen, indem Sie die verbleibende Menge des Bead-Verdünnungsmittels hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration jedes Antikörpers im Cocktail 1X beträgt. Bereiten Sie immer mindestens 20 % zusätzliches Volumen der Cocktaillösung für den Fall von Pipettierfehlern vor.
Anmerkung: Bereiten Sie beispielsweise für einen 96-Well-Assay 3000 μl Antikörperbead-Cocktail-Lösung vor. Die erforderliche Menge jeder Antikörperbead-Lösung = 3000/Stammkonzentration jeder Antikörperbead-Lösung; 3000/50 = 60 μl jeder Antikörper-Bead-Lösung
- Geben Sie 60 μl jeder der 41 Antikörper-Bead-Lösungen (60 x 41 = 2460 μl) in eine Cocktailflasche und fügen Sie 540 μl Bead-Verdünnungslösung zur Antikörper-Bead-Mischung hinzu, um 3000 μl endgültige Arbeitslösung (1X) herzustellen.
- Mischen Sie die Bead-Cocktail-Lösung vor der Verwendung richtig. Nach dem Assay lagern Sie das verbleibende Volumen bis zu 30 Tage lang bei 2-8 °C.
- Bereiten Sie die Qualitätskontrollen (QC) vor, indem Sie 250 μl deionisiertes Wasser zu den Beständen QC 1 und QC 2 hinzufügen.
- Richtig mischen, indem Sie die Flaschen mehrmals umdrehen und 10 Sekunden lang vortexen. Füllen Sie die Lösung in ordnungsgemäß markierte Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen um und lagern Sie die restliche Lösung bei -20 °C, die bis zu 30 Tage lang verwendet werden kann.
- Bereiten Sie den Waschpuffer vor, indem Sie 270 mL deionisiertes Wasser zu 30 mL 10X Waschpufferlösung hinzufügen und gut mischen (vor der Verdünnung den 10X Puffer auf Raumtemperatur bringen und alle Salzausfällungen durch Mischen auflösen). Lagern Sie den unbenutzten Waschpuffer (1X) bei 2-8 °C, der bis zu 30 Tage lang verwendet werden kann.
- Bereiten Sie den humanen Zytokin-Standardstamm (10.000 pg/ml aller Analyten) vor, indem Sie 250 μl deionisiertes Wasser in das Vorratsfläschchen geben. Gut mischen, indem Sie das Fläschchen mehrmals umdrehen und 10 Sekunden lang vortexen. Lassen Sie es 10 Minuten stehen und geben Sie die Stammlösung in ordnungsgemäß etikettierte Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie die restliche Lösung nach dem Assay bei -20 °C, die bis zu 30 Tage lang verwendet werden kann.
- Bereiten Sie die funktionierenden humanen Zytokinstandards durch 5-fache serielle Verdünnungen (50 μl -> 200 μl) mit Assay-Puffer vor, um 2000, 400, 80, 16 und 3,2 pg/ml zu erhalten.
- Nach der Standardvorbereitung verwenden Sie die Arbeitsstandards innerhalb von 60 Minuten und verwenden Sie den Assay-Puffer als Blind-/Hintergrundpuffer (-pg/ml).
- Erstellung von Zytokinprofilen durch Bead-basierten Multiplex-Assays:
- Bringen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur und wirbeln Sie sie 5-10 Sekunden lang, bevor Sie sie in die 96-Well-Mikrotiterplatte geben. Wenn eluierte Tränenproben vor dem Assay bei -80 °C gelagert werden, tauen Sie die gefrorenen Tränenextrakte auf Eis auf und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 1000 x g.
- Bereiten Sie ein Assay-Arbeitsblatt in einer vertikalen Konfiguration für die Arbeit mit humanen Zytokinstandards [0 (Leer), 3,2, 16, 80, 400, 2.000 und 10.000 pg/ml], QC1, QC2 und Proben vor.
- Geben Sie 200 μl 1X-Waschpuffer in jede Vertiefung der Platte, verschließen Sie sie mit einem Plattenversiegeler und bewahren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (20-25 °C) auf einem Plattenschüttler auf.
- Dekantieren Sie den 1X-Waschpuffer, indem Sie die Platte umdrehen und mehrmals auf saugfähige Handtücher kleben, um die Restmenge des Waschpuffers in den Vertiefungen zu entfernen.
- Geben Sie 25 μl jedes funktionierenden humanen Zytokinstandards, QC1, QC2, Blindwert (Assay-Puffer) und Proben in die entsprechenden Wells.
- Geben Sie 25 μl Assay-Puffer in jede Vertiefung
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- Geben Sie 25 μl 1X Antikörperbead-Cocktaillösung in jede Vertiefung. Da die Antikörperbead-Lösung lichtempfindlich ist, versiegeln Sie die Platte mit einem Plattenversiegeler und decken Sie sie mit Aluminiumfolie ab, um sie während des Assays vor Licht zu schützen.
- Die Platte über Nacht bei 4 °C auf einem Shaker inkubieren.
- Legen Sie die Platte auf das Plattengestell einer automatischen magnetischen Plattenwaschmaschine. Lassen Sie es 1 Minute lang einwirken, um die magnetischen Kügelchen am Boden der Vertiefung abzusetzen und den Inhalt der Vertiefung abzusaugen. Fügen Sie 200 μl Waschpuffer pro Vertiefung hinzu, lassen Sie ihn 1 Minute ruhen und aspirieren Sie dann den Inhalt der Vertiefung. Wiederholen Sie den Waschgang noch einmal (für die Tellerwäsche befolgen Sie die Anweisungen des Kit-Herstellers).
- Geben Sie 25 μl Nachweisantikörperlösung in jede Vertiefung, verschließen Sie die Platte, decken Sie sie mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.
- Geben Sie 25 μl Streptavidin-Phycoerythrin-Lösung in jede Vertiefung, verschließen Sie die Platte, decken Sie sie mit Alufolie ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Shaker.
- Legen Sie die Platte auf eine magnetische Plattenunterlegscheibe. Lassen Sie es 1 Minute ruhen und saugen Sie dann den Inhalt der Vertiefung ab. Fügen Sie 200 μl Waschpuffer pro Vertiefung hinzu. Lassen Sie es 1 Minute ruhen und saugen Sie dann den Inhalt der Vertiefung ab. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal.
- Geben Sie 150 μl Mantelflüssigkeit in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte 5 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Shaker, um die Antikörperkügelchen zu resuspendieren.
- Lesen Sie die Platte sofort mit dem bead-basierten Multiplex-Assay-Platten-Reader ab und analysieren Sie die Zytokinkonzentrationen mit einem 5-Parameter-Kurvenanpassungsalgorithmus. Ein schematisches Flussdiagramm der Profilerstellung von Tränenzytokinen ist in Abbildung 1 dargestellt.
- Ablesen der Assay-Platte (Geräteeinstellung) und Datenanalyse:
- Schalten Sie den beadbasierten Multiplex-Assay-Reader ein und wärmen Sie den Laser 30 Minuten lang vor.
- Markteinführung der bead-basierten Multiplex-Assay-Software. Wählen Sie auf der Registerkarte "Automatisierte Wartung" die Option "Kalibrierung-Verifizierung". Jedes Reagenzfläschchen mit den Kalibrier- und Verifizierungsperlen 30 Sekunden lang vortexen. Geben Sie 5 Tropfen jedes Reagenzes in die dafür vorgesehenen Vertiefungen. Füllen Sie die dafür vorgesehenen Behälter mit entionisiertem Wasser und 70 % Ethanol.
