Verwendung von Immun-RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung zur Visualisierung von SARS-CoV-2

>1. SARS-CoV-2 RNA-FISH in Vero-Zellen, die auf Deckgläsern kultiviert wurden

TAG 1

1. Fixierung und Permeabilisierung von Zellen
   1. Fixieren Sie infizierte Zellen mit 3,7 % w/v PFA-Lösung für 1 h bei RT.
   2. Aspirieren Sie die 3,7%ige PFA-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
   3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit PBST-Lösung für 10 min bei RT unter Rühren.
   4. Aspirieren Sie das PBST und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
2. Erkennung
   1. Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2x SSC bei RT.
   2. Aspirieren Sie die 2x SSC-Lösung und prähybridisieren Sie die Proben, indem Sie mindestens 300 μl Sondenhybridisierungspuffer hinzufügen. Decken Sie die Vertiefungen mit den Zellen ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 °C.
   3. Bereiten Sie die Sondenlösung vor, indem Sie 1,2 pmol Sondengemisch zum Sondenhybridisierungspuffer hinzufügen.
      1. Verwenden Sie 1,2 μl des 1 μM-Sondenmaterials, um 300 μl Arbeitsmaterial vorzubereiten.
   4. Entfernen Sie die Prähybridisierungslösung und bringen Sie die Deckgläser in eine befeuchtete Kammer.
      1. Pipettieren Sie 30-50 μl Sondenlösung auf Parafilm, um einzelne Tröpfchen zu bilden.
   5. Die Proben über Nacht (12-18 h) bei 37 °C inkubieren.

TAG 2

1. Übertragen Sie die Deckgläser zurück in eine 12-Well-Platte und entfernen Sie überschüssige Sondenlösung, indem Sie sie 4 x 5 Minuten lang mit 400 μl Sondenwaschpuffer bei 37 °C waschen.
   Anmerkung: Als Alternative zum Platzieren von 30-50 μl Aliquots auf Parafilm und unter Deckgläsern für die Inkubation können Sie 300 μl Sondenlösung direkt auf Deckgläser in einer 12-Well-Platte geben. Dieses Verfahren ist einfacher, erfordert aber erhebliche Mengen an Reagenzien. Erhitzen Sie den Sondenwaschpuffer vor Gebrauch auf 37 °C. Berechnen Sie die benötigte Puffermenge und übertragen Sie sie in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
2. Proben 2 x 5 min mit 5x SSCT bei RT waschen.
3. Ersetzen Sie die 5x SSCT-Lösung durch 1x PBS und lagern Sie die Proben bis zur Amplifikation bei 4 °C.

>3. Verstärkung

1. Entfernen Sie die 1x PBS-Lösung aus den Vertiefungen und fügen Sie mindestens 300 μl Amplifikationspuffer in jede Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei RT.
2. Bereiten Sie jede HCR-Haarnadel (h1 und h2) vor, indem Sie das gewünschte Volumen in separaten Röhrchen abkühlen.
   1. Zur Herstellung von 300 μl Amplifikationslösung verwenden Sie 18 pmol von jeder Haarnadel (z. B. für 300 μl 6 μl einer 3 μM Stammhaarnadellösung).
   2. Füllen Sie die Haarnadellösung in Röhrchen um.
   3. Inkubieren Sie bei 95 °C für 90 s.
   4. 30 Minuten im Dunkeln auf RT abkühlen lassen.
3. Bereiten Sie eine Haarnadelmischung vor, indem Sie die snap-gekühlten Haarnadeln "h1" und "h2" zum Amplifikationspuffer hinzufügen.
4. Tropfen von 30-50 μl Haarnadelmischung auf Parafilm geben.
5. Inkubieren Sie die Proben über Nacht (12-18 h) im Dunkeln bei RT.

TAG 3

6. Übertragen Sie die Deckgläser zurück in die 12-Well-Platte und entfernen Sie überschüssige Haarnadeln, indem Sie sie 5 x 5 Minuten lang mit 5x SSCT bei RT unter Rühren waschen.
7. Aspirieren Sie den 5x SSCT-Puffer und ersetzen Sie ihn durch 1x PBS.
   Anmerkung: Falls erforderlich, verwenden Sie die RNA-FISH-Proben in einem Standard-Immunfluoreszenz-Assay, gefolgt von einer Färbung der Zellkerne (siehe Abschnitt 1.4).

4. Kernfärbung und Diamontage

1. Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung und ersetzen Sie sie durch 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 0,2 μg/ml) in 1x PBS-Lösung.
2. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
3. Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
4. Geben Sie zwei Tropfen zu je 10 μl Eindeckmedium; stellen Sie sicher, dass die Tropfen ausreichend voneinander getrennt sind, damit zwei Deckgläser auf einen einzigen Objektträger gelegt werden können.
5. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Sie die Deckgläser auf ein sauberes Handtuch klopfen und sie dann mit den Zellen nach unten in ein lichtbeständiges Eindeckmittel legen.
6. Legen Sie die eingespannten Proben im Dunkeln auf eine trockene, ebene Oberfläche und lassen Sie sie aushärten.
7. Versiegeln Sie nach dem Aushärten die Ränder der Deckgläser mit VALAP Dichtmittel oder Nagellack, um ein Austrocknen der Proben zu verhindern.

>2. SARS-CoV-2 RNA-FISH in HAE-Kulturen

TAG 1

1. Fixierung und Permeabilisierung der HAE-Kultur
   1. Aspirieren Sie das Medium und fixieren Sie die infizierten Zellen mit 3,7%iger PFA-Lösung für 1 h bei RT.
   2. Aspirieren Sie die 3,7%ige PFA-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
      1. Ersetzen Sie die 3,7%ige PFA-Lösung durch 1x PBS unter einem Transwell-Einsatz.
   3. Entsorgen Sie das PBS und dehydrieren Sie die Proben mit 2 x 5 Minuten Wäschen mit 100 % MeOH, das auf -20 °C vorgekühlt wurde.
   4. Ersetzen Sie nach der zweiten Wäsche den Puffer durch frisches, gekühltes MeOH zur Permeabilisierung unter dem Transwell-Einsatz. Über Nacht bei -20 °C lagern.

TAG 2

2. Rehydrierung
   Rehydrieren Sie die Proben durch eine abgestufte Reihe von MeOH/PBST-Lösungen (jeweils für 5 Minuten) auf Eis: 75 % MeOH/25 % PBST, 50 % MeOH/50 % PBST, 25 % MeOH/75 % PBTS und 100 % PBST (zweimal).
   1. Waschen Sie die Zellen 5 min auf Eis mit 50% 5x SSCT/50% PBST.
   2. Waschen Sie die Zellen 5 min lang auf Eis mit 5x SSCT.
   3. Ersetzen Sie den 5x SSCT-Puffer durch 1x PBS.
3. Erkennung
   1. Inkubieren Sie die Zellen (im Transwell-Einsatz) 5 Minuten lang auf Eis mit 100 μl Sonden-Hybridisierungspuffer. Anschließend wird die Platte für 30 Minuten bei 37 °C in einen Inkubator umgestellt (Prähybridisierung).
      Anmerkung: Der Sonden-Hybridisierungspuffer muss vor der Verwendung auf 37 °C vorgewärmt werden. Berechnen Sie das erforderliche Volumen: 100 μl werden für eine einzelne Transwell-Wendeschneidplatte benötigt.
   2. Bereiten Sie die Sondenlösung vor. Da für 1 ml Sondenlösung 4 pmol Sonde benötigt werden, geben Sie 4 μl 1 μM Sondenstammlösung zu 1 mL Sondenhybridisierungspuffer und mischen Sie gut.
      Anmerkung: Verwenden Sie für den RNA-Nachweis 100 μl Sondenlösung pro Transwell-Einsatz. Lassen Sie die Sondenlösung bis zum Ende des Prähybridisierungsschritts auf Eis.
   3. Entfernen Sie die Prähybridisierungslösung, und fügen Sie die Sondenlösung hinzu.
   4. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht (12-18 h) bei 37 °C.

TAG 3

5. Entfernen Sie überschüssige Sonde, indem Sie sie 4 x 15 Minuten lang mit 100 μl Sondenwaschpuffer bei 37 °C waschen.
6. Waschen Sie die Proben 2 x 5 min mit 5x SSCT bei RT.
7. Ersetzen Sie die 5x SSCT durch 1x PBS und lagern Sie die Proben bis zur Amplifikation bei 4 °C.

4. Verstärkung

1. Amplifizieren Sie die Proben vor, indem Sie sie 30 Minuten lang mit einem Amplifikationspuffer bei RT inkubieren.
2. Bereiten Sie jede Haarnadel vor, indem Sie die gewünschten Volumina in separaten Röhrchen abkühlen.
   1. Um 500 μl Amplifikationslösung herzustellen, verwenden Sie 30 pmol von jeder Haarnadel (z. B. für 500 μl 10 μl 3 μM Stammhaarnadellösung).
   2. Übertragen Sie die Haarnadellösung auf die Röhrchen.
   3. Inkubieren Sie bei 95 °C für 90 s.
   4. 30 Minuten im Dunkeln auf RT abkühlen lassen.
3. Bereiten Sie die Hairpin-Lösung vor, indem Sie alle snap-gekühlten Hairpins zu 500 μl Amplifikationspuffer bei RT hinzufügen.
4. Entfernen Sie die Voramplifikationslösung und fügen Sie die vollständige Haarnadellösung hinzu.
5. Inkubieren Sie die Proben über Nacht (12-18 h) bei RT im Dunkeln.
6. Entfernen Sie überschüssige Haarnadeln, indem Sie sie mit 5x SSCT bei RT wie folgt waschen: 2 x 5 min, 2 x 15 min und 1 x 5 min.
7. Ersetzen Sie die 5x SSCT-Lösung durch 1x PBS und lagern Sie sie nicht länger als 2-3 Tage bei 4 °C oder fahren Sie direkt mit der Kernfärbung fort.
   Anmerkung: Falls erforderlich, verwenden Sie die RNA-FISH-Proben in einem Standard-Immunfluoreszenz-Assay, gefolgt von einer Kernfärbung (siehe Abschnitt 3).

>5. Kernfärbung und Diamontage

1. Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung und ersetzen Sie sie durch DAPI-Lösung (0,2 μg/ml) in 1x PBS.
2. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
3. Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
4. Legen Sie die ausgeschnittene Membran aus den Transwell-Einsätzen mit den Zellen nach oben auf 10 μl Antifading-Eindeckmedium und fügen Sie der Membran zusätzliches Eindeckmedium (5 μl) hinzu.
5. Decken Sie die Membranen mit Deckgläsern ab.
6. Härten Sie die eingefassten Proben auf einer trockenen, ebenen Oberfläche im Dunkeln aus.
7. Versiegeln Sie nach dem Aushärten die Ränder der Deckgläser mit VALAP Dichtmittel oder Nagellack, um ein Austrocknen der Proben zu verhindern.

>3. Immunfluoreszenzanalyse von Vero-Zellen und HAE-Kulturen

HINWEIS: Führen Sie den Immunfluoreszenz-Assay an Tag 3 für Zelllinien oder Tag 4 für HAE-Kulturen durch. Verwenden Sie für jedes Modell einen anderen Ansatz. Alle Unterschiede sind deutlich gekennzeichnet.

1. Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung aus den Vertiefungen.
2. Die Proben werden durch Inkubation mit 1 % w/v Rinderserumalbumin in PBST-Lösung für 30 min bei 37 °C blockiert.
3. Bereiten Sie Primärantikörper vor, indem Sie geeignete Verdünnungen in Blockierungslösung vorbereiten, und inkubieren Sie.
   1. Für Vero-Zellen auf Deckgläsern:
      1. Tropfen (30-50 μl) der Antikörperlösung auf den Parafilm in einer Feuchtigkeitskammer geben.
      2. Legen Sie Deckgläser mit den Zellen nach unten auf die Antikörpertropfen.
   2. Bei HAE ist das Blockierungsmittel in den Einsätzen durch Antikörperlösung (100 μl) zu ersetzen und die Proben in einer befeuchteten Kammer zu inkubieren.
      HINWEIS: Passen Sie die Zeit und Temperatur für jede Inkubation mit dem Primärantikörper an. Typische Parameter sind 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C.
4. Waschen Sie die Proben 3 x 5 min mit PBST.
   1. Für Zellen auf Deckgläsern auf eine 12-Well-Platte umfüllen und PBST-Lösung hinzufügen.
   2. Ersetzen Sie bei HAE-Kulturen die Antikörperlösung durch die PBST-Lösung.
5. Überprüfen Sie die für das Konfokalmikroskop verfügbaren Lichtquellen und Filter.
6. Wählen Sie Sekundärantikörper entsprechend der Wirtsspezies. Wählen Sie die Fluorophor-Parameter (Anregungs- und Emissionswellenlängen, Spektrumbreite und Anregungseffizienz entsprechend der verfügbaren Lichtquelle).
   Anmerkung: Spektrale Parameter können mit Hilfe von Online-Tools modelliert werden (siehe Materialtabelle).
7. Bereiten Sie geeignete Sekundärantikörperlösungen vor, indem Sie sie mit einer Blockierungslösung verdünnen.
8. Mit Sekundärantikörpern inkubieren (wie in 6.3), aber 1 h bei 37 °C inkubieren.
9. Waschen Sie die Proben wie in Schritt 3.4.
10. Nukleare Färbung und Diamontage
    1. Für Zellen auf Deckgläsern
       1. Aspirieren Sie das PBST und ersetzen Sie es durch DAPI (0,2 μg/ml) in 1x PBS-Lösung.
       2. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
       3. Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
       4. Legen Sie die Deckgläser mit den Zellen nach unten auf Tropfen von 10 μl Eindeckmedium.
       5. Versiegeln Sie die Deckgläser mit Nagellack.
    2. Für HAE-Kulturen
       1. Aspirieren Sie das 1x PBST und ersetzen Sie es durch DAPI (0,2 μg/ml) in 1x PBS-Lösung.
       2. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
       3. Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
       4. Legen Sie die ausgeschnittenen Membranen mit den Zellen nach oben auf Tropfen von 10 μl Eindeckmedium und fügen Sie der Membran ein zusätzliches Eindeckmedium (5 μl) hinzu.
       5. Decken Sie die Membranen mit Deckgläsern ab.
       6. Versiegeln Sie die Deckgläser mit Nagellack.

>4. Konfokale Mikroskopie

1. Definieren Sie die Spuren, indem Sie die verwendeten Fluorophore angeben.
2. Wählen Sie den Scanmodus und die Geschwindigkeit.
3. Passen Sie die Laserleistung, die Verstärkung und die Offset-Werte für jedes Fluorophor an, indem Sie sie mit den entsprechenden Negativkontrollen vergleichen: für Virus, scheininfizierte Zellen, für zelluläre Proteine Proben, die mit Isotyp-Kontrollantikörpern von einem geeigneten Wirt gefärbt wurden.
4. Um ein 3D-Bild zu erfassen, aktivieren Sie den Z-Stapel-Modus und legen Sie die obere und untere Grenze fest. Legen Sie die Schrittgröße/-anzahl fest.
   Anmerkung: Weitere Informationen zur Coronavirus-Bildgebung
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