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>1. SARS-CoV-2 RNA-FISH in Vero-Zellen, die auf Deckgläsern kultiviert wurden
TAG 1
- Fixierung und Permeabilisierung von Zellen
- Fixieren Sie infizierte Zellen mit 3,7 % w/v PFA-Lösung für 1 h bei RT.
- Aspirieren Sie die 3,7%ige PFA-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
- Permeabilisieren Sie die Zellen mit PBST-Lösung für 10 min bei RT unter Rühren.
- Aspirieren Sie das PBST und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
- Erkennung
- Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2x SSC bei RT.
- Aspirieren Sie die 2x SSC-Lösung und prähybridisieren Sie die Proben, indem Sie mindestens 300 μl Sondenhybridisierungspuffer hinzufügen. Decken Sie die Vertiefungen mit den Zellen ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 °C.
- Bereiten Sie die Sondenlösung vor, indem Sie 1,2 pmol Sondengemisch zum Sondenhybridisierungspuffer hinzufügen.
- Verwenden Sie 1,2 μl des 1 μM-Sondenmaterials, um 300 μl Arbeitsmaterial vorzubereiten.
- Entfernen Sie die Prähybridisierungslösung und bringen Sie die Deckgläser in eine befeuchtete Kammer.
- Pipettieren Sie 30-50 μl Sondenlösung auf Parafilm, um einzelne Tröpfchen zu bilden.
- Die Proben über Nacht (12-18 h) bei 37 °C inkubieren.
TAG 2
- Übertragen Sie die Deckgläser zurück in eine 12-Well-Platte und entfernen Sie überschüssige Sondenlösung, indem Sie sie 4 x 5 Minuten lang mit 400 μl Sondenwaschpuffer bei 37 °C waschen.
Anmerkung: Als Alternative zum Platzieren von 30-50 μl Aliquots auf Parafilm und unter Deckgläsern für die Inkubation können Sie 300 μl Sondenlösung direkt auf Deckgläser in einer 12-Well-Platte geben. Dieses Verfahren ist einfacher, erfordert aber erhebliche Mengen an Reagenzien. Erhitzen Sie den Sondenwaschpuffer vor Gebrauch auf 37 °C. Berechnen Sie die benötigte Puffermenge und übertragen Sie sie in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Proben 2 x 5 min mit 5x SSCT bei RT waschen.
- Ersetzen Sie die 5x SSCT-Lösung durch 1x PBS und lagern Sie die Proben bis zur Amplifikation bei 4 °C.
>3. Verstärkung
- Entfernen Sie die 1x PBS-Lösung aus den Vertiefungen und fügen Sie mindestens 300 μl Amplifikationspuffer in jede Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei RT.
- Bereiten Sie jede HCR-Haarnadel (h1 und h2) vor, indem Sie das gewünschte Volumen in separaten Röhrchen abkühlen.
- Zur Herstellung von 300 μl Amplifikationslösung verwenden Sie 18 pmol von jeder Haarnadel (z. B. für 300 μl 6 μl einer 3 μM Stammhaarnadellösung).
- Füllen Sie die Haarnadellösung in Röhrchen um.
- Inkubieren Sie bei 95 °C für 90 s.
- 30 Minuten im Dunkeln auf RT abkühlen lassen.
- Bereiten Sie eine Haarnadelmischung vor, indem Sie die snap-gekühlten Haarnadeln "h1" und "h2" zum Amplifikationspuffer hinzufügen.
- Tropfen von 30-50 μl Haarnadelmischung auf Parafilm geben.
- Inkubieren Sie die Proben über Nacht (12-18 h) im Dunkeln bei RT.
TAG 3
- Übertragen Sie die Deckgläser zurück in die 12-Well-Platte und entfernen Sie überschüssige Haarnadeln, indem Sie sie 5 x 5 Minuten lang mit 5x SSCT bei RT unter Rühren waschen.
- Aspirieren Sie den 5x SSCT-Puffer und ersetzen Sie ihn durch 1x PBS.
Anmerkung: Falls erforderlich, verwenden Sie die RNA-FISH-Proben in einem Standard-Immunfluoreszenz-Assay, gefolgt von einer Färbung der Zellkerne (siehe Abschnitt 1.4).
4. Kernfärbung und Diamontage
- Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung und ersetzen Sie sie durch 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 0,2 μg/ml) in 1x PBS-Lösung.
- Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
- Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
- Geben Sie zwei Tropfen zu je 10 μl Eindeckmedium; stellen Sie sicher, dass die Tropfen ausreichend voneinander getrennt sind, damit zwei Deckgläser auf einen einzigen Objektträger gelegt werden können.
- Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Sie die Deckgläser auf ein sauberes Handtuch klopfen und sie dann mit den Zellen nach unten in ein lichtbeständiges Eindeckmittel legen.
- Legen Sie die eingespannten Proben im Dunkeln auf eine trockene, ebene Oberfläche und lassen Sie sie aushärten.
- Versiegeln Sie nach dem Aushärten die Ränder der Deckgläser mit VALAP Dichtmittel oder Nagellack, um ein Austrocknen der Proben zu verhindern.
>2. SARS-CoV-2 RNA-FISH in HAE-Kulturen
TAG 1
- Fixierung und Permeabilisierung der HAE-Kultur
- Aspirieren Sie das Medium und fixieren Sie die infizierten Zellen mit 3,7%iger PFA-Lösung für 1 h bei RT.
- Aspirieren Sie die 3,7%ige PFA-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
- Ersetzen Sie die 3,7%ige PFA-Lösung durch 1x PBS unter einem Transwell-Einsatz.
- Entsorgen Sie das PBS und dehydrieren Sie die Proben mit 2 x 5 Minuten Wäschen mit 100 % MeOH, das auf -20 °C vorgekühlt wurde.
- Ersetzen Sie nach der zweiten Wäsche den Puffer durch frisches, gekühltes MeOH zur Permeabilisierung unter dem Transwell-Einsatz. Über Nacht bei -20 °C lagern.
TAG 2
- Rehydrierung
Rehydrieren Sie die Proben durch eine abgestufte Reihe von MeOH/PBST-Lösungen (jeweils für 5 Minuten) auf Eis: 75 % MeOH/25 % PBST, 50 % MeOH/50 % PBST, 25 % MeOH/75 % PBTS und 100 % PBST (zweimal).
- Waschen Sie die Zellen 5 min auf Eis mit 50% 5x SSCT/50% PBST.
- Waschen Sie die Zellen 5 min lang auf Eis mit 5x SSCT.
- Ersetzen Sie den 5x SSCT-Puffer durch 1x PBS.
- Erkennung
- Inkubieren Sie die Zellen (im Transwell-Einsatz) 5 Minuten lang auf Eis mit 100 μl Sonden-Hybridisierungspuffer. Anschließend wird die Platte für 30 Minuten bei 37 °C in einen Inkubator umgestellt (Prähybridisierung).
Anmerkung: Der Sonden-Hybridisierungspuffer muss vor der Verwendung auf 37 °C vorgewärmt werden. Berechnen Sie das erforderliche Volumen: 100 μl werden für eine einzelne Transwell-Wendeschneidplatte benötigt.
- Bereiten Sie die Sondenlösung vor. Da für 1 ml Sondenlösung 4 pmol Sonde benötigt werden, geben Sie 4 μl 1 μM Sondenstammlösung zu 1 mL Sondenhybridisierungspuffer und mischen Sie gut.
Anmerkung: Verwenden Sie für den RNA-Nachweis 100 μl Sondenlösung pro Transwell-Einsatz. Lassen Sie die Sondenlösung bis zum Ende des Prähybridisierungsschritts auf Eis.
- Entfernen Sie die Prähybridisierungslösung, und fügen Sie die Sondenlösung hinzu.
- Inkubieren Sie die Zellen über Nacht (12-18 h) bei 37 °C.
TAG 3
- Entfernen Sie überschüssige Sonde, indem Sie sie 4 x 15 Minuten lang mit 100 μl Sondenwaschpuffer bei 37 °C waschen.
- Waschen Sie die Proben 2 x 5 min mit 5x SSCT bei RT.
- Ersetzen Sie die 5x SSCT durch 1x PBS und lagern Sie die Proben bis zur Amplifikation bei 4 °C.
- Verstärkung
- Amplifizieren Sie die Proben vor, indem Sie sie 30 Minuten lang mit einem Amplifikationspuffer bei RT inkubieren.
- Bereiten Sie jede Haarnadel vor, indem Sie die gewünschten Volumina in separaten Röhrchen abkühlen.
- Um 500 μl Amplifikationslösung herzustellen, verwenden Sie 30 pmol von jeder Haarnadel (z. B. für 500 μl 10 μl 3 μM Stammhaarnadellösung).
- Übertragen Sie die Haarnadellösung auf die Röhrchen.
- Inkubieren Sie bei 95 °C für 90 s.
- 30 Minuten im Dunkeln auf RT abkühlen lassen.
- Bereiten Sie die Hairpin-Lösung vor, indem Sie alle snap-gekühlten Hairpins zu 500 μl Amplifikationspuffer bei RT hinzufügen.
- Entfernen Sie die Voramplifikationslösung und fügen Sie die vollständige Haarnadellösung hinzu.
- Inkubieren Sie die Proben über Nacht (12-18 h) bei RT im Dunkeln.
- Entfernen Sie überschüssige Haarnadeln, indem Sie sie mit 5x SSCT bei RT wie folgt waschen: 2 x 5 min, 2 x 15 min und 1 x 5 min.
- Ersetzen Sie die 5x SSCT-Lösung durch 1x PBS und lagern Sie sie nicht länger als 2-3 Tage bei 4 °C oder fahren Sie direkt mit der Kernfärbung fort.
Anmerkung: Falls erforderlich, verwenden Sie die RNA-FISH-Proben in einem Standard-Immunfluoreszenz-Assay, gefolgt von einer Kernfärbung (siehe Abschnitt 3).
>5. Kernfärbung und Diamontage
- Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung und ersetzen Sie sie durch DAPI-Lösung (0,2 μg/ml) in 1x PBS.
- Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
- Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
- Legen Sie die ausgeschnittene Membran aus den Transwell-Einsätzen mit den Zellen nach oben auf 10 μl Antifading-Eindeckmedium und fügen Sie der Membran zusätzliches Eindeckmedium (5 μl) hinzu.
- Decken Sie die Membranen mit Deckgläsern ab.
- Härten Sie die eingefassten Proben auf einer trockenen, ebenen Oberfläche im Dunkeln aus.
- Versiegeln Sie nach dem Aushärten die Ränder der Deckgläser mit VALAP Dichtmittel oder Nagellack, um ein Austrocknen der Proben zu verhindern.
>3. Immunfluoreszenzanalyse von Vero-Zellen und HAE-Kulturen
HINWEIS: Führen Sie den Immunfluoreszenz-Assay an Tag 3 für Zelllinien oder Tag 4 für HAE-Kulturen durch. Verwenden Sie für jedes Modell einen anderen Ansatz. Alle Unterschiede sind deutlich gekennzeichnet.
- Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung aus den Vertiefungen.
- Die Proben werden durch Inkubation mit 1 % w/v Rinderserumalbumin in PBST-Lösung für 30 min bei 37 °C blockiert.
- Bereiten Sie Primärantikörper vor, indem Sie geeignete Verdünnungen in Blockierungslösung vorbereiten, und inkubieren Sie.
- Für Vero-Zellen auf Deckgläsern:
- Tropfen (30-50 μl) der Antikörperlösung auf den Parafilm in einer Feuchtigkeitskammer geben.
- Legen Sie Deckgläser mit den Zellen nach unten auf die Antikörpertropfen.
- Bei HAE ist das Blockierungsmittel in den Einsätzen durch Antikörperlösung (100 μl) zu ersetzen und die Proben in einer befeuchteten Kammer zu inkubieren.
HINWEIS: Passen Sie die Zeit und Temperatur für jede Inkubation mit dem Primärantikörper an. Typische Parameter sind 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C.
- Waschen Sie die Proben 3 x 5 min mit PBST.
- Für Zellen auf Deckgläsern auf eine 12-Well-Platte umfüllen und PBST-Lösung hinzufügen.
- Ersetzen Sie bei HAE-Kulturen die Antikörperlösung durch die PBST-Lösung.
- Überprüfen Sie die für das Konfokalmikroskop verfügbaren Lichtquellen und Filter.
- Wählen Sie Sekundärantikörper entsprechend der Wirtsspezies. Wählen Sie die Fluorophor-Parameter (Anregungs- und Emissionswellenlängen, Spektrumbreite und Anregungseffizienz entsprechend der verfügbaren Lichtquelle).
Anmerkung: Spektrale Parameter können mit Hilfe von Online-Tools modelliert werden (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie geeignete Sekundärantikörperlösungen vor, indem Sie sie mit einer Blockierungslösung verdünnen.
- Mit Sekundärantikörpern inkubieren (wie in 6.3), aber 1 h bei 37 °C inkubieren.
- Waschen Sie die Proben wie in Schritt 3.4.
- Nukleare Färbung und Diamontage
- Für Zellen auf Deckgläsern
- Aspirieren Sie das PBST und ersetzen Sie es durch DAPI (0,2 μg/ml) in 1x PBS-Lösung.
- Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
- Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
- Legen Sie die Deckgläser mit den Zellen nach unten auf Tropfen von 10 μl Eindeckmedium.
- Versiegeln Sie die Deckgläser mit Nagellack.
- Für HAE-Kulturen
- Aspirieren Sie das 1x PBST und ersetzen Sie es durch DAPI (0,2 μg/ml) in 1x PBS-Lösung.
- Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
- Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
- Legen Sie die ausgeschnittenen Membranen mit den Zellen nach oben auf Tropfen von 10 μl Eindeckmedium und fügen Sie der Membran ein zusätzliches Eindeckmedium (5 μl) hinzu.
- Decken Sie die Membranen mit Deckgläsern ab.
- Versiegeln Sie die Deckgläser mit Nagellack.
>4. Konfokale Mikroskopie
- Definieren Sie die Spuren, indem Sie die verwendeten Fluorophore angeben.
- Wählen Sie den Scanmodus und die Geschwindigkeit.
- Passen Sie die Laserleistung, die Verstärkung und die Offset-Werte für jedes Fluorophor an, indem Sie sie mit den entsprechenden Negativkontrollen vergleichen: für Virus, scheininfizierte Zellen, für zelluläre Proteine Proben, die mit Isotyp-Kontrollantikörpern von einem geeigneten Wirt gefärbt wurden.
- Um ein 3D-Bild zu erfassen, aktivieren Sie den Z-Stapel-Modus und legen Sie die obere und untere Grenze fest. Legen Sie die Schrittgröße/-anzahl fest.
Anmerkung: Weitere Informationen zur Coronavirus-Bildgebung .